胃癌表面细胞鉴定的材料与方法

1.1 主要材料与设备

细胞系 ：MGC-803 和 MKN-45，BGC-823 。实验动物 ：BALB/c-nu 小鼠，雌性，4 周龄。主要试剂 ：DMEM、RPMI 1640、DMEM/F12 培养基、N2、B27 ，重组人表皮细胞生长因子（recombinant human epidermal growth factor, EGF）、重组人碱性成纤维生长因子（recombinant human basicfibroblast growth factor, bFGF），胎牛血清，胰酶、四甲基偶氮唑盐（MTT），青霉素、链霉素，二甲基亚砜（DMSO）、氟尿嘧啶，结晶紫，Aldefluor 试剂盒，普通和倒置光学显微镜，酶联免疫检测仪，流式细胞仪。

1.2 方法

1.2.1细胞培养及 ALDH1 表达检测

MGC-803 用含10% 胎牛血清的 DMEM 培养液，BGC-823 和 MKN-45 用含 10% 胎牛血清的 RPMI 1640 培养液，以上细胞置于 37℃、5% CO 2 培养箱内培养。MGC-803 和 BGC-823 用 0.25% 胰酶消化传代，MKN-45 用 0.05% 胰酶加0.02% EDTA 消化传代。分选后的 ALDH1+ 、ALDH1 -细胞用无血清培养液（含 0.5% N2、1% B27、20 ng/ml EGF 及 10 ng/ml bFGF 的 DMEM/F12 培养基），置于 37℃、5% CO 2 培养箱内培养。选取对数生长期细胞，制备浓度为 1×106个 /ml单细胞悬液，实验组加入活化的 Aldefluor 试剂 5 μl/ml，ALDH 能将 BAAA 转化为绿色发光物 BAA，通过专用通道分选带绿色荧光 BAA 细胞；对照组加入特殊抑制剂 DEAB 50 μl/ml，DEAB 能抑制 ALDH把 BAAA 转化为 BAA，作为阴性对照。反应 30 min。1 000 r/min 离心 5 min，弃上清液，Aldefluor 缓冲液重悬，上机检测，检测前加碘化丙啶（PI）染色标记死亡细胞。

1.2.2ALDH1+细胞分化（不对称分裂）能力检测

MGC-803 及分选得到 ALDH1+细胞和 ALDH1-细胞，以 5×104个 /ml 接种于含 10% 胎牛血清的 DMEM培养液，37℃、5% CO 2 培养箱中培养。1 周后流式细胞仪检测 ALDH1+
所占比例情况。

1.2.3平板克隆实验

ALDH1+和 ALDH1-细胞分别以 200 个细胞 / 孔接种于 6 孔板，用无血清培养液，置于 37℃、5% CO 2 培养箱培养 10 ～ 14 d，至细胞克隆超过 50 个细胞时结束培养，100% 甲醇室温固定，结晶紫室温染色后流水冲洗染料，计数每孔克隆形成数。克隆形成率 = 每孔克隆形成数 / 每孔接种细胞数×100%。

1.2.4耐药实验

分选获得的 ALDH1+及 ALDH1-细胞分为两组，两组分别以 3×103个细胞 / 孔接种于 96孔板，无血清培养液培养 24 h 后分别加入 1 μg/ml、2、5、15 和 25 μg/ml 的氟尿嘧啶，每个浓度设 3 ～ 5个复孔，以不加药物的复孔为对照组，培养 24 h 后，MTT 法检测各组 OD 值，以只加 DMSO 孔为调零孔。细胞生长抑制率 =[1-（实验组平均 OD 值 - 调零孔OD 值）/ （对照组平均 OD 值 - 调零孔 OD 值）]×100%。

1.2.5致瘤实验

ALDH1+及 ALDH1-细胞，悬浮于PBS 缓冲液与基质胶（1 ∶ 1）混合液中，5×103细胞数量级的 ALDH1+细胞及 ALDH1-细胞皮下接种于BALB/c-nu 小鼠，每组 4 只小鼠。观察出瘤情况，测量瘤体长短径，记录瘤体出现时间及个数。待瘤体直径超过 1 cm 时处死小鼠，取出瘤体测量体积，瘤体体积 =1/2 长径 × 短径 × 短径。取肿瘤组织进行病理学检查。

1.3 统计学方法

数据分析采用 SPSS 17.0 统计软件，计量资料以均数 ± 标准差（x±s）表示，采用方差分析，组间比较用 t 检验，计数资料以频数（%）表示，率的比较用χ2检验， P <0.05 为差异有统计学意义。