ATCC细胞传代操作步骤

ATCC细胞传代操作：

1.吸除培育瓶内旧培育液。

2.参加无菌pbs洗液（5-8mL）轻轻潮湿细胞，稀释多余的培育基，之后吸走洗液，动作要轻，不可吹打到细胞。

3.向瓶内参加含0.25%EDTA的胰蛋白酶混合液少量，以能覆满瓶底为限。 

4.置温箱中2~5分钟，一旦镜检发现细胞质回缩，细胞间隙增大后，细胞变圆，比较松动后，当即停止消化。

5.参加该细胞对应的培育基6mL（T25培育瓶）或12mL（T75培育瓶）停止消化。

6.用吸管通过汲取的培育基轻轻重复吹打瓶壁细胞，使之从瓶壁脱离构成细胞悬液。吹打时应尽量以少的次数将细胞从壁上吹下，不仅要操控吹打的力度、次数，还要注意要将细胞尽可能吹成单个。这样既能减少死细胞，又能便于细胞再次均匀贴壁成长。

7.根据传代比例，将细胞悬液分瓶，再弥补培育基后，静置于温箱培育，直止贴壁。
贴壁细胞在培育瓶长成致密单层后，持续成长的空间缺乏，培育基中的养分成份也消耗较多，一起代谢废物也有较多堆积，需求分瓶培育，对细胞进行传代扩增。对于贴壁
不太紧的细胞如293，可以直接吹散后分瓶。而对于贴壁较紧的细胞如CHO，则需求以胰酶消化后再吹散分瓶。以笔者的经历，以轻吹或加培育液后轻摇可下较好，但对于经历不太充沛的实验者而言是较难判断把握的。

ATCC细胞培养方法：

细胞传代：细胞密度达到80-90%时即可传代

①弃去培养上清，用PBS或生理盐水清洗1-2次；

②加入2ml0.25%胰酶（T25瓶），使胰酶覆盖整个瓶或皿，盖好放入培养箱消化；

③1-2min后，显微镜下观察细胞，若大部分细胞回缩且有少量细胞脱落，轻轻吹打下确认消化情况后加入完全培养基终止消化；若细胞还是贴壁，放回培养箱继续消化至可以轻轻吹打下为止；

④将细胞悬液1000RPM左右条件下离心4min，弃上清；

⑤用新鲜培养基重悬后加入培养瓶或皿中，T25培养瓶加6-8ml培养基；

⑥悬浮细胞直接离心收集，细胞沉淀重悬后分到新培养瓶中。