上海邦景实业有限公司
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ATCC细胞培养方法几点
人阅读 发布时间：2021-04-28 13:57
ATCC细胞操作方法
（1）取成年新西兰大白兔，耳缘静脉注射空气处死后，取下兔子的双腿，立即用75%乙醇浸泡。
（2）移入细胞房内，去除双腿表面的皮毛及肌肉，剪取关节段，移至超菌工作台内。
（3）PBS洗涤数次，用手术刀或弯剪将关节表面的软骨组织取下。
（4）软骨组织块静置5min，弃去上层液体及悬浮组织，将软骨组织剪成1mm3的大小。移到离心管中加3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化15-20min；
（5） 4℃静置5min；弃上清，PBS洗涤，去上清。加入0.2%胶原酶II，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化2H；
（6）加入生长培养基终止消化，反复吹打后依次通过200目滤网。收集滤液,1200rpm离心8min，弃上清，用DMEM完全培养基重新悬浮细胞, 放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
（7）细胞传代后放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养。细胞完全展开后即可固定做原代鉴定。
ATCC细胞培养方法:
1.细菌污染
细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
2.真菌污染
真菌污染是细胞培养过程中常见的一种，常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
3.支原体污染
支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。
培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
4.病毒污染
组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。
（1）取成年新西兰大白兔，耳缘静脉注射空气处死后，取下兔子的双腿，立即用75%乙醇浸泡。
（2）移入细胞房内，去除双腿表面的皮毛及肌肉，剪取关节段，移至超菌工作台内。
（3）PBS洗涤数次，用手术刀或弯剪将关节表面的软骨组织取下。
（4）软骨组织块静置5min，弃去上层液体及悬浮组织，将软骨组织剪成1mm3的大小。移到离心管中加3倍体积的0.25%胰蛋白酶，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化15-20min；
（5） 4℃静置5min；弃上清，PBS洗涤，去上清。加入0.2%胶原酶II，置入37℃的恒温摇床中，振荡消化2H；
（6）加入生长培养基终止消化，反复吹打后依次通过200目滤网。收集滤液,1200rpm离心8min，弃上清，用DMEM完全培养基重新悬浮细胞, 放入37℃，5%CO2细胞培养箱中培养；
（7）细胞传代后放入预置有薄骨片或盖玻片的培养板中进行培养。细胞完全展开后即可固定做原代鉴定。
ATCC细胞培养方法:
1.细菌污染
细菌污染是实验室细胞培养中常见的污染，即使在细胞培养液中加入了抗菌素，也可能因为操作不慎而引起污染。常见的有革兰氏阳性菌，如枯草杆菌以及大肠杆菌、假单胞菌等革兰氏阴性菌，其中又以白色葡萄球菌较常见。
培养细胞受细菌污染后，会出现培养液变混浊，pH改变。污染后细胞发生病理改变，胞内颗粒增多、增粗，最后变圆脱落死亡。
2.真菌污染
真菌污染是细胞培养过程中常见的一种，常见的真菌有烟曲霉、黑曲菌、孔子霉、毛霉菌、白色念珠菌和酵母菌。
培养细胞受真菌污染后，可见培养液中漂浮着白色或浅黄色的小点，有的散在生长，培养液一般不发生混浊；倒置显微镜下可见丝状、管状或树枝状的菌丝纵横交错在细胞之间或培养基中，有的呈链状排列。
真菌污染后，细胞生长变慢，但最后由于营养耗尽及毒性作用而使细胞脱落死亡。
3.支原体污染
支原体是介于细菌与病毒之间能独立生活的最小微生物，最小直径0.2μm，一般过滤除菌无法去除它，光镜下难以看清它的形态结构。开始不易发现，能在偏碱条件下生存，对青霉素有抗药性。多吸附于细胞表面或散在于细胞之间。
培养细胞受支原体污染后，部分敏感细胞可见细胞生长增殖变慢，部分细胞变圆，从瓶壁脱落。但多数细胞污染后无明显变化，或略有变化，若不及时处理，还会产生交叉污染。
4.病毒污染
组织细胞培养过程中，如果没有除去潜在的病毒，就会产生病毒污染。目前，从原代猴肾细胞的培养中已发现不少于20种血清性病毒。
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