ELISA试验样本科学处理方法

Elisa是一种快速、灵敏、准确可靠的定量分析方法。准备工作，如果收集处理好样本对于 Elisa 实验的成功有举足轻重的作用。现和大家分享一下有关ELISA检测样本的收集处理方法。
利用 ELISA 进行检测的样本类型包括：血液（血清、血浆），组织匀浆、细胞裂解液、细胞培养上清，皮肤组织、尿液、粪便、肺泡灌洗液、唾液、脑脊液、胸腹水、前列腺液、精液、阴道分泌物等。
下面我们就常见的样本处理方法：
血液样本
血液采取后应尽快进行处理，使血清（浆）从与血细胞接触的全血中分离出来。
Q: 血清与血浆的区别?
A: 血清是血液凝固后缺少纤维蛋原的血浆，故血浆中除尚含有纤维蛋白原和 抗凝剂外，其他成份均等同于血清。
Q: 选择血清还是血浆样本？
A: 由于血清中缺乏很多的凝血因子，但有凝血产物。如果测凝血因子建议选择血浆样本；同时血浆中有纤维蛋白原，如果纤维蛋白原对待检测指标有影响，建议选择血清样本。
大多数情况下二者均可以选择。
处理方法：
1.血清
将收集于血清分离管的全血标本在室温放置 2 小时或 4 度过夜，然后1000×g 离心20分钟，取上清即可。这是一个让血液自然凝固的过程，温度越低，凝集越缓慢，可根据需要添加促凝剂。
                                
2.血浆
血浆样本需要抗凝，一般建议用2.0%EDTA，1%肝素，3.8%枸橼酸钠作为抗凝剂采集标本，并将标本在采集后的30分钟内于2~8度1000g离心15分钟，取上清即可检测。根据待检测目标物的性质不同选取不同的抗凝剂。

1）. 枸橼酸钠(柠檬酸钠)：Ca2+有凝血作用，枸橼酸钠能与血液中的钙离子形成可溶性的螯合物，从而阻止血液凝固。配成 109mmol/L的浓度和血液1:9, 106mmol/L的浓度和血液1:4
缺点：血液中溶解度低，抗凝作用较弱。
优点：对凝血因子有很好的保护作用，大部分凝血试验都可用枸橼酸钠抗凝。

2）. 二胺四乙酸（EDTA）盐：与血液中的钙离子结合形成配位化合物， 从而阻止血液凝固。15g/L EDTA和血液 1:10
优点：对红细胞和白细胞形态影响小。
缺点：影响血小板的聚集。不适用于凝血实验和血小板功能相关实验的检 测。

3）. 肝素：通过与抗凝血酶Ⅲ结合，增强抗凝血酶的作用，灭活丝氨酸蛋白 酶，从而可阻止凝血酶的形成和阻止血小板聚集，阻止血液凝固。肝素钠 1g/L 与血液 1:10
优点：抗凝能力强、不影响血细胞体积、不易溶血、能耐高温。
缺点：引起白细胞聚集。肝素抗凝血应于短时间内使用，否则放置过久血 液又可凝固。
               
3.细胞培养上清液

将细胞培养上清液吸入离心管中并以1000×g离心20分钟，除去细胞碎片和杂质，收集上清液备用，样本保存在-20℃或-80℃，避免反复冻融。

4.细胞
反复冻融方法：
(1)吸出培养板中的培养基，用胰蛋白酶消化细胞，然后加入适量的培养基将培养板上的细胞冲洗干净。悬浮细胞可以省略该步骤。
(2)将细胞悬浮液收集到离心管中，以1000×g离心10分钟，然后吸去培养基，用预冷PBS洗涤细胞3次。
(3)加入适量的预冷PBS（建议在使用前立即加入蛋白酶抑制剂）重悬细胞。在6孔培养板中，每个孔需要150-250μL的PBS来重悬细胞。
(4)使样本在-20℃或-80℃条件和室温条件下反复冻融，重复冻融过程数次，直至细胞完全裂解。也可以使用超声波细胞破碎器超声处理悬浮液来裂解细胞。
(5)4℃下以10,000×g离心10分钟，去除细胞碎片，收集上清液， -20℃或-80℃保存，避免反复冻融。

5.组织匀浆

(1)用预冷的PBS（0.01M，PH7.4）冲洗组织以除去表面残留的血液或杂质。

(2)将组织块称重，然后切成尽可能小的碎块，以便充分匀浆。

(3)加入适量的预冷PBS（体积取决于组织的重量，9 mL PBS适用于1 g组织，建议使用前立即在PBS中加入适量蛋白酶抑制剂），用玻璃匀浆器在冰上或冰浴中充分匀浆。

(4)将匀浆液吸入离心管中，4℃ 下以5000×g离心5~10分钟，收集上清液，保存至-20℃或-80℃，避免反复冻融。

6.尿液、唾液及其他生物体液

以1000×g离心20分钟，收集上清液，立即进行测定。

一般来说，由于ELISA实验只能检测可溶性蛋白质的含量，因此要求样本应清晰透明并离心除去沉淀物或悬浮物质。为确保实验的准确性， -20℃或-80℃保存的样本应在1-6个月内完成检测，4℃保存的样本在一周内完成检测。此外，样本中不能含有会抑制HRP活性的NaN3，否则会造成假阴性结果。