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公司新闻/正文
Western免疫印迹知识小课堂
317 人阅读发布时间：2021-12-21 13:39
Western免疫印迹（Western Blot）是将蛋白质转移到膜上，然后利用抗体进行检测。对已知表达蛋白，可用相应抗体作为一抗进行检测，对新基因的表达产物，可通过融合部分的抗体检测。
以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术：
一、 原理
与 Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰an凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝 酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗 体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋 白水平的表达。
二、分类
western显色的方法主要有以下几种：
1. 放射自显影
2. 底物化学发光ECL
3. 底物荧光ECF
4. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行， 操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、步骤
蛋白样品制备
培养的细胞（定性）
1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。
3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。
4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
7.待样品恢复到室温后上样。
培养的细胞（定量）
1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
4.12000g离心，4℃，2min。
5.取少量上清进行定量。
6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
（二）SDS－PAGE电泳
（1） 清洗玻璃板
（2） 灌胶与上样
（3） 电泳
（三） 转膜
（四） 免疫反应
（五） 化学发光，显影，定影
（六） 凝胶图象分析 将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
四、常见问题
1. Western blot结果中的背景为什么较高?
可能的原因及建议
膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。
膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
检测时曝光时间过长——减少曝光时间。
2. Western blot结果中杂带较多
可能的原因及建议
目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。
样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
上样量过高，太敏感——适当减少上样量。
一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。
一抗不纯——纯化抗体
一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。
3. Western blot结果中无信号或显示信号弱
可能的原因及建议
检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
一抗孵育时间不足——建议4℃结合过夜。
二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。
洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
4. 其它现象：
膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。
反白（条带显白色）——目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。
蛋白分子量偏低或偏高——胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。
以下几个方面来详细地介绍一下Western Blot技术：
一、 原理
与 Southern或Northern杂交方法类似，但Western Blot采用的是聚丙烯酰an凝胶电泳，被检测物是蛋白质，“探针”是抗体，“显色”用标记的二抗。经过PAGE分离的蛋白质样品，转移到固相载体（例如硝 酸纤维素薄膜）上，固相载体以非共价键形式吸附蛋白质，且能保持电泳分离的多肽类型及其生物学活性不变。
以固相载体上的蛋白质或多肽作为抗原，与对应的抗 体起免疫反应，再与酶或同位素标记的第二抗体起反应，经过底物显色或放射自显影以检测电泳分离的特异性目的基因表达的蛋白成分。该技术也广泛应用于检测蛋 白水平的表达。
二、分类
western显色的方法主要有以下几种：
1. 放射自显影
2. 底物化学发光ECL
3. 底物荧光ECF
4. 底物DAB呈色
现常用的有底物化学发光ECL和底物DAB呈色，体同水平和实验条件的是用第一种方法，目前发表文章通常是用底物化学发光ECL。只要买现成的试剂盒就行， 操作也比较简单，原理如下（二抗用HRP标记）：反应底物为过氧化物+鲁米诺，如遇到HRP，即发光，可使胶片曝光，就可洗出条带。
三、步骤
蛋白样品制备
培养的细胞（定性）
1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.对于6孔板来说每孔加200~300uL，60~80℃的1×loading buffer。
3.刮下的细胞在EP管中煮沸10min，期间vortex 2~3次。
4.用干净的针尖挑丝，将团块弃掉，如果没有团块但有拉丝现象，可将EP管置于0℃后在5.14000~16000g离心2min，再次挑丝。若无团块也无丝状物但溶液有些粘稠，可使用1ml注射器反6.复抽吸来降低溶液粘滞度，便于上样。
7.待样品恢复到室温后上样。
培养的细胞（定量）
1.去培养液后用温的PBS冲洗2~3遍（冷的PBS有可能使细胞脱落）。
2.加入适量的冰预冷的裂解液后置于冰上10~20min。
3.刮下的细胞收集在EP管后超声（100~200w）3s，2次。
4.12000g离心，4℃，2min。
5.取少量上清进行定量。
6.将所有蛋白样品调至等浓度，充分混合沉淀后加loading buffer后直接上样最好，剩余溶液（溶于1×loading buffer）可以低温储存，-70℃一个月，-20℃一周，4℃ 1~2天，每次上样前98℃，3min。
（二）SDS－PAGE电泳
（1） 清洗玻璃板
（2） 灌胶与上样
（3） 电泳
（三） 转膜
（四） 免疫反应
（五） 化学发光，显影，定影
（六） 凝胶图象分析 将胶片进行扫描或拍照，用凝胶图象处理系统分析目标带的分子量和净光密度值。
四、常见问题
1. Western blot结果中的背景为什么较高?
可能的原因及建议
膜封闭不够——延长封闭的时间；选择更加适合的封闭液。
一抗稀释度不适宜——对抗体进行滴度测试，选择最适宜的抗体稀释度。
一抗孵育的温度偏高——建议4℃结合过夜。
膜在实验过程中干过——实验过程中要注意保持膜的湿润。
检测时曝光时间过长——减少曝光时间。
2. Western blot结果中杂带较多
可能的原因及建议
目的蛋白有多个修饰位点（磷酸化位点、糖基化位点、乙酰化位点等），本身可以呈现多条带。
查阅文献或进行生物信息学分析，获得蛋白序列的修饰位点信息，通过去修饰确定蛋白实际大小。
目的蛋白有其它剪切本——查阅文献或生物信息学分析可能性。
样本处理过程中目的蛋白发生降解——加入蛋白酶抑制剂；样本处理时在冰上操作。
上样量过高，太敏感——适当减少上样量。
一抗特异性不高——重新选择或制备高特异性的抗体。
一抗不纯——纯化抗体
一抗或者二抗浓度偏高——降低抗体浓度。
3. Western blot结果中无信号或显示信号弱
可能的原因及建议
检测样本不表达目的蛋白——选择表达量高的细胞作为阳性对照，用于确定检测样本是否为阴性。
检测样本低表达目的蛋白——提高上样量，裂解液中注意加入蛋白酶抑制剂。
转移不完全或过转移——可以用丽春红染膜并结合染胶（考马斯亮蓝）后确定条带是否转至膜上或转移过头；适当调整转膜的时间和电流。
抗体不能识别测试种属的相关蛋白——购买抗体前应当认真阅读抗体说明书，确定其是否能够交叉识别测试种属的对应蛋白。
一抗孵育时间不足——建议4℃结合过夜。
二抗与一抗不匹配——选择针对一抗来源的种属的抗体。
洗膜过度——洗膜时间不宜过长，加入的去垢剂不宜过强或过多，建议使用0.1%的弱去垢剂Tween-20。
4. 其它现象：
膜上多处出现黑点或黑斑——抗体与封闭试剂发生非特异性的结合。
反白（条带显白色）——目的蛋白含量太高或者一抗浓度偏高。
蛋白分子量偏低或偏高——胶浓度不适合，高分子量要用低浓度胶；小分子蛋白要用高浓度胶。