聚合酶链式（PCR）反应原理步骤及常见解答

PCR 全称多聚酶链式反应（polymerase chain reaction），是一种非常强大的技术，可以通过一种非常简单但是高效的方法来复制 DNA，它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制，PCR 的最大特点是是可以以微量的 DNA 为模板，快速扩增得到大量拷贝。
为什么要复制 DNA？DNA 复制是很多研究的基础，例如，当我们对 RNA 进行测序时，必须先将 RNA 转化为 DNA，并进行大量复制。在对于某个人进行基因组测序时，我们不能对于某个细胞或者单个分子进行测序。测序的基础要求拥有大量的相同的 DNA 分子拷贝，因此，DNA 复制是做生物研究中的基础工具。那么怎么获取这么多拷贝呢？PCR 正是一个复印机一般的存在，利用 DNA 的几个特性，成为批量复制 DNA 的极好方法。



一、实验原理

聚合酶链反应 (PCR) 技术是在体外进行的由引物介导的酶促 DNA 扩增反应。PCR 的原理是在模板 DNA、PCR 引物、四种脱氧核糖核苷酸 (dNTP) 及适当浓度的 Mg2+存在的条件下，依赖于 DNA 聚合酶的体外酶促合成反应。两个引物分别位于靶序列两端，同两条模板的 3』端互补，由此限定扩增片段。PCR 反应由一系列的变性→退火→延伸反复循环构成，即在高温下模板双链 DNA 变性解链，然后在较低温度下同过量引物退火，再在适中温度下由 DNA 聚合酶催化进行延伸。理论上，经过 N 次循环可使特定片段扩增到 2n-1，考虑到扩增效率达不到 100%，所以通常经 25 到 30 次循环可扩增到 106 倍，足够后续实验展开。



二、反应基本组成

1、DNA 模板（template）：含有待扩增的 DNA 片段。
2、2 条引物（primer）：决定了需要扩增的起始和终止位置。
3、DNA 聚合酶（polymerase）：复制需要扩增的区域，耐高温的 Taq 酶最为常见，其在 DNA 变性过程中仍具活性。
4、4 种脱氧核苷三磷酸（dNTPs）：DNA 聚合酶可以从中合成新的 DNA 互补链。
5、含有镁离子的缓冲体系，提供适合聚合酶行使功能的化学环境。

三、反应步骤

1、变性：利用高温（93-98℃）使双链 DNA 解螺旋，高温使两条 DNA 链间的氢键断裂。在第一个循环之前，通常加热时间较长以确保模板 DNA 完全分离，仅以单链形式存在。该步骤时间 1-2 分钟，接下来机器就控制温度进入循环阶段。
2、退火：将反应温度降低至 50-65℃（通常比引物 值低 3-5℃）持续 20-40s，从而使引物结合于单链 DNA 上。若退火温度过低，容易造成非特异扩增，而退火温度过高，引物可能根本不结合。
3、延伸：此步骤的温度取决于所用的 DNA 聚合酶。 Taq（Thermus aquaticus）聚合酶的热稳定 DNA 聚合酶的最佳活性温度约为 75–80°C，但通常使用的延伸温度为 72°C。 在这一步骤中，DNA 聚合酶通过从反应体系中添加的 5' 至 3' 方向的游离 dNTP，从而合成与 DNA 模板链互补的新 DNA 链。延伸所需的精确时间取决于所用的 DNA 聚合酶和待扩增的 DNA 片段的长度。 传统的 Taq 酶估计合成 1000bp 大概需要 1 分钟、较新的 Tbr 酶（来自于嗜热菌 Thermus brockianus）约 40s、商业公司生产的融合型聚合酶仅需约 10-15s。有修正功能的则会比较慢。
上述循环结束后，将进入终延伸阶段：此步骤是可选的，但要在 70-74°C）（PCR 中使用的大多数聚合酶最佳活性所需的温度范围）下进行 5-15 分钟。 最后一个 PCR 循环，以确保所有剩余的单链 DNA 的冈崎片段被补齐。
最终保持：最后一步将 PCR 仪反应室无限期地冷却至 4–15°C，可用于 PCR 产物的短期保存。



四、常见问题分析与解决方法

1. 无扩增条带

1）酶失活或在反应体系中未加入酶。Taq DNA 聚合酶因保存或运输不当而失活，往往通过更换新酶或用另一来源的酶以获得满意的结果。
2）模板含有杂质。特别是对甲醛固定及石蜡包埋的组织常含甲酸，造成 DNA 脱嘌呤而影响 PCR 的结果。
3）变性温度是否准确：PCR 仪指示温度与实际温度是否相符，过高酶在前几个循环就迅速失活；过低则模板变性不彻底。
4）反应系统中污染了蛋白酶及核酸酶，应在未加 Taq 酶以前，将反应体系 95℃ 加热 5-10 min。
5）引物变质失效。人工合成的引物是否正确。是否纯化，或因储存条件不当而失活。
6）引物错误。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
7）DNA 凝胶电泳时加入阳性对照，确保不是 DNA 凝胶和 PCR 程序的问题。

2. PCR 产物量过少

1）退火温度不合适。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。
2）DNA 模板量太少。增加 DNA 模板量。
3）PCR 循环数不足。增加反应循环数。
4）引物量不足。增加体系中引物含量。
5）延伸时间太短。以 1 kb/min 的原则设置延伸时间。
6）变性时间过长。变性时间过长会导致 DNA 聚合酶失活。DNA 模板中存在抑制剂。确保 DNA 模板干净。

3. 扩增产物在凝胶中涂布或成片状条带弥散

1）酶量过高。减少酶量；酶的质量差，调换另一来源的酶。
2）dNTP 浓度过高。减少 dNTP 的浓度。
3）MgCl2 浓度过高。可适当降低其用量。
4）模板量过多。质粒 DNA 的用量应 <50 ng，而基因组 DNA 则应 <200 ng。
5）引物浓度不够优化。对引物进行梯度稀释重复 PCR 反应。
6）循环次数过多；增加模板量减少循环次数至 30，缩短退火时间及延伸时间，或改用二种温度的 PCR 循环。
7）退火温度过低。
8）电泳体系有问题：
①凝胶中缓冲液和电泳缓冲液浓度相差太大；
②凝胶没有凝固好；
③琼脂糖质量差。
9）若为 PCR 试剂盒则可能：
①　由于运输储存不当引起试剂盒失效；
②　试剂盒本身质量有问题，如引物选择、循环参数等选择不当。
10）降解的陈旧模板扩增也易产生涂布。

4. 扩增产物出现多条带 (杂带)

1）引物用量偏大，引物的特异性不高。应调换引物或降低引物的使用量。
2）循环的次数过多。适当增加模板的量，减少循环次数。
3）酶的用量偏高或酶的质量不好，应降低酶量或调换另一来源的酶。
4）退火温度偏低，退火及延伸时间偏长。应提高退火温度，减少变性与延伸时间，也可采用二种温度的 PCR 扩增。以 2 度为梯度设计梯度 PCR 反应优化退火温度。
5）样品处理不当。
6）Mg2+浓度偏高，因适当调整 Mg2+使用浓度。
7）若为 PCR 试剂盒，也可能时试剂盒本身质量有问题。
8）复制提前终止。使用非热启动的聚合酶时常有发生。冰上准备反应体系或采用热启动聚合酶。
9）反应缓冲液未完全融化或未充分混匀。确保反应缓冲液融化完全并彻底混匀。
10）引物特异性差。利用 BLAST 检查引物特异性或重新设计引物。
11）引物量过多。减少反应体系中引物的用量。
12）模板量过多。质粒 DNA 的用量应 <50ng，而基因组 DNA 则应 <200ng。
13）外源 DNA 污染。确保操作的洁净。

5. 阴性对照出现条带

试剂，枪头，工作台污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。

6. 条带大小与理论不符

1）污染。使用全新的试剂和枪头，对工作台进行清洁。
2）模板或引物使用错误。更换引物和模板。
3）基因亚型。对研究的基因进行序列分析和 BLAST 研究。