​PCR实验过程问题解答

PCR 实验包括反应体系的配置和反应程序，反应体系中有模板、引物、dNTP、酶、buffer、Mg2 +，反应程序又包括预变性、变性、退火、延伸和彻底延伸。那么在 PCR 出现问题时主要是从反应体系的各个组分和反应程序上来进行调节优化。​PCR实验过程问题解答：

1、如何确定引物的浓度？

前面我们说到，引物一般交由试剂公司合成，有时候具体的浓度我们也不能确定。有些人喜欢稀释十倍，有些人喜欢稀释二十倍。我个人认为比较稳妥的做法是在每次拿到反转的 cDNA 后，先会稀释 3 倍左右，然后利用管家基因做一次 RT-PCR，循环数一般为 25 循环，鉴定一下具体浓度，再决定最后的稀释倍数。

2、合成的引物是我们想要的引物吗？

一般来说在拿到很多引物的时候，可以通过普通的 PCR 看看是否是单一条带，鉴定一下引物的特异性。如果实验室不差钱，则可以通过溶解曲线对所有的引物的特异性做一次鉴定。

3、操作过程中需要注意哪些问题？

一定要戴手套，戴手套，戴手套，重要的事情说三遍。根据经验，少量模板的加入，容易造成加样误差。所以为了尽量减少加入少量模板造成的误差，我们一般会将样本再稀释一倍，加样的时候多加一倍，减少 H2O  的加入量。

4、你确定你的 PCR 板和仪器配套吗？

你用的是 BIO-RAD 公司的定量 PCR 仪器，那么你一定要买配套该仪器的 qRT-PCR 板。因为不兼容的 PCR 板会导致结果偏差。这种状况实验小白尤其需要注意。

5、凝胶放入电泳槽有什么注意事项吗？

凝胶放入电泳槽时一定要注意方向，核酸是带负电的，所以电泳的方向是从负极向正极跑，因此，加样孔一定要对着负极放置，不然样本就跑到胶外面去了。