应用ELISA 实验中各种样本处理与保存

能够应用 ELISA 实验的样本种类很多，有血清，血浆，细胞上清，细胞裂解液，尿液，关节滑液，脑脊液，肺泡灌洗液，各种组织的组织匀浆；采集和处理的方式都不相同。下面就列出各类样本的采集、处理和保存方式仅供参考。
一、ELISA 实验中血清的采集、处理和保存；

1、真空采血针采集 2ml 新鲜血液，加入无菌试管中；

2、采血后室温静置 1 小时；

3、将采集血液用离心机 4℃，2500rpm 离心 10min，，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。

4、取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存 24-48 小时；

-20℃下，可放置保存 1 个月；

-70℃下，可放置保存 6 个月；

5、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。

大部分 ELISA 检测均以血清为标本。血清标本可按常规方法采集，应注意避免溶血，红细胞溶解时会释放出具有过氧化物酶活性的物质，以 HRP 为标记的 ELISA 测定中，溶血标本可能会增加非特异性显色。此外还应避免细菌污染，因为菌体中可能含有含有内源性 HRP，也会产生假阳性反应。血清标本宜在新鲜 时检测。如在冰箱中保存过久，其中的可发生聚合，间接法 ELISA 中可使本底加深。

二、ELISA 实验中血浆的采集、处理和保存；

1、真空采血针采集 2ml 新鲜血液，加入无菌试管中；

2、按 1:9 加入抗凝剂（EDTA、草酸钠、肝素、枸橼酸钠），30 分钟内于冰上分离血浆以减少血小板的污染；（也可以直接用抗凝管采集）；

3、将采集血液用离心机 4℃，2500rpm 离心 5min，，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。

4、取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存 24-48 小时；

-20℃下，可放置保存 1 个月；

-70℃下，可放置保存 6 个月；

5、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。 请注意指标说明书上对于抗凝血剂是否有特殊要求，建议使用 EDTA。血浆中除尚含有纤维蛋白原和抗凝剂外，其他成份均同等于血清。

注意事项：制备血浆标本需借助于抗凝剂 EDTA,抗凝不完全的标本因纤维蛋白原干扰而造成假阳性。

三、ELISA 实验中尿液的采集、处理和保存；

1、采集尿液样本 500ul，加入无菌试管中；

2、将采集血液用离心机 4℃，2500rpm 离心 10min，，将离心好的样本留上清，弃下面沉淀。

3、取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存 24-48 小时；

-20℃下，可放置保存 1 个月；

-70℃下，可放置保存 6 个月；

4、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。

四、ELISA 实验中脑脊液的采集、处理和保存；

1、采集脑脊液样本，加入无菌试管中；

2、将采集血液用离心机 4℃，2500rpm 离心 10min，，将离心好的样本留上清，弃下面沉淀。

3、取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存 24-48 小时；

-20℃下，可放置保存 1 个月；

-70℃下，可放置保存 6 个月；

4、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。

五、ELISA 实验中细胞上清液的采集、处理和保存；

1、采集细胞培养上清液 500ul，加入无菌试管中；

2、分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存 24-48 小时；

-20℃下，可放置保存 1 个月；

-70℃下，可放置保存 6 个月；

3、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。

六、ELISA 实验中细胞裂解液的采集、处理和保存；（需要测蛋白浓度）

1、取细胞培养板或细胞悬液，用 PBS（PH7.2-7.4）洗涤细胞培养板 1-2 次。

2、通过反复冻融或加入组织蛋白萃取试剂（裂解液），使细胞破坏并放出细胞内成份。

3、将采集血液用离心机 4℃，2500rpm 离心 20min，，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。

4、取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存 24-48 小时；

-20℃下，可放置保存 1 个月；

-70℃下，可放置保存 6 个月；

5、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。

七、ELISA 实验中肺泡灌洗液的采集、处理和保存；

1、10%水合氯醛溶液，腹腔麻醉。

2、打开腹腔，另取 10ml 注射器行下腔静脉采血，尽可能将血放尽。

3、在冰面上对左肺进行肺灌洗。取 37℃生理盐水 5ml，分三次灌洗：2ml、1.5ml、1.5ml灌洗。回收率在 70%以上。

4、将肺泡灌洗液用离心机 4℃，1500rpm 离心 10min。

5、取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存 24-48 小时；

-20℃下，可放置保存 1 个月；

-70℃下，可放置保存 6 个月；

6、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。

八、ELISA 实验中关节滑液的采集、处理和保存；

1、口腔关节：患者取坐位，常规消毒后，作皮下及关节后区局部浸润麻醉。然后嘱患者大张口，采用装有 2ml 生理盐水的注射器（5 号针头）作关节上腔 穿刺，髁后进针，针尖方向斜向前、内、上，抵达关节结节后斜面后稍后退，回抽如发现有淡黄色液体，即表明已进入关节上腔，注入 2ml 生理盐水，反复注入、 回抽五次。

膝骨关节滑液：无菌穿刺取得关节液。

2、将关节液用离心机 4℃，1500rpm 离心 15min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。

3、取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存 24-48 小时；

-20℃下，可放置保存 1 个月；

-70℃下，可放置保存 6 个月；

4、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。

九、ELISA 实验中各类组织匀浆（容易匀浆的组织）的采集、处理和保存；（需要测蛋白浓度）

1、 采集组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，剔除附属的结缔组织，称取组织块。

2、用移液管量取 0.1M PBS 或者用 0.86％冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的 9 倍，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天然时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织 的小烧杯放入冰水中）。

3、匀浆的方式有多种：

a) 手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下 端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8 分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

b) 机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000r/min 上下研磨制成 10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒，连续 3～5 次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

4、将制备好的 10％匀浆用离心机 4℃，3000rpm 离心 15min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。

5、取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存 24-48 小时；

-20℃下，可放置保存 1 个月；

-70℃下，可放置保存 6 个月；

6、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。

十、ELISA 实验中各类组织匀浆（不易匀浆的组织）的采集、处理和保存；（需要测蛋白浓度）

1、采集组织，在冰冷的生理盐水中漂洗，除去血液，滤纸拭干，称重，剔除附属的结缔组织，称取组织块。

2、用移液管量取 0.1M PBS 或者用 0.86％冷生理盐水，匀浆介质或生理盐水的体积总量应该是组织块重量的 9 倍，用眼科小剪尽快剪碎组织块（天然时操作要在冰水浴中进行，将盛有组织 的小烧杯放入冰水中）。

3、匀浆的方式有多种：

a)手工匀浆：将剪碎的组织倒入玻璃匀浆管中，再将剩余的 1/3 匀浆介质或生理盐水冲洗残留在烧杯中的碎组织块，一起倒入匀浆管中进行匀浆，左手持匀浆管将下 端插入盛有冰水混合物的器皿中，右手将捣杆垂直插入套管中，上下转动研磨数十次（6～8 分钟），充分研碎，使组织匀浆化。

b)机器匀浆：用组织捣碎机 10000～15000r/min 上下研磨制成 10％组织匀浆，也可用内切式组织匀浆机制备（匀浆时间 10 秒/次，间隙 30 秒，连续 3～5 次，在冰水中进行），皮肤、肌肉组织等可延长匀浆时间。

c) 超声粉碎：用超声粉碎机进行粉碎，可用 Soniprep150 型超声波发生器以振幅 14 微米超声处理 30 秒使细胞破碎，也可用国产超声波发生仪，用 40 安培，5 秒/次，间隙 10 秒反复 3～5 次。

4、将制备好的 10％匀浆用离心机 4℃，3000rpm 离心 15min，将离心好的匀浆留上清，弃下面沉淀。

5、取上清。 分装冻存备用，

2-8℃下，可放置保存 24-48 小时；

-20℃下，可放置保存 1 个月；

-70℃下，可放置保存 6 个月；

6、根据你的实验需要，取适量上清夜进行各种 ELISA 测定。