PCR试剂盒样品RNA的抽提步骤及抽提技巧

   在分子生物学研究中，有很多实验需要获得目的基因的序列进而确定基因的表达水平，这就需要得到样品中高质量、高纯度的RNA，本文就RNA提取的原理、方法和注意事项进行总结，并提供了不同类型样品RNA提取的推荐试剂盒。

RNA提取的基本原理：
1、高浓度蛋白质变性剂的裂解方法，是抽提RNA的优选方案。
2、总RNA的抽提，最重要的是快速裂解细胞膜，而在DNA提取过程中存在的基因组与蛋白质“缠”住的问题，并不会对后续的纯化过程产生大的影响，可以不考虑。
3、高浓度蛋白质变性剂能快速破坏细胞膜，进而迅速抑制住细胞内的RNA酶，从而保证了RNA的完整性，绝大部分样品的RNA抽提方法，都是以高浓度的蛋白质变性剂为基础的。

样品RNA的抽提步骤：
1、取冻存已裂解的细胞，室温放置5分钟使其完全溶解。
2、两相分离 每1ml的TRIZOL试剂裂解的样品中加入0.2ml的，盖紧管盖。手动剧烈振荡管体15秒后，15到30℃孵育2到3分钟。4℃下12000rpm离心15分钟。离心后混合液体将分为下层的红色酚相，中间层以及无色水相上层。RNA全部被分配于水相中。水相上层的体积大约是匀浆时加入的TRIZOL试剂的60%。
3、RNA沉淀 将水相上层转移到一干净无RNA酶的离心管中。加等体积异丙醇混合以沉淀其中的RNA，混匀后15到30℃孵育10分钟后，于4℃下12000rpm 离心10分钟。此时离心前不可见的RNA沉淀将在管底部和侧壁上形成胶状沉淀块。
4、RNA清洗 移去上清液，每1mlTRIZOL试剂裂解的样品中加入至少1ml的75%乙醇（75%乙醇用DEPCH2O配制），清洗RNA沉淀。混匀后，4℃下7000rpm离心5分钟。
5、RNA干燥 小心吸去大部分乙醇溶液，使RNA沉淀在室温空气中干燥5-10分钟。
6、溶解RNA沉淀 溶解RNA时，先加入无RNA酶的水40μl用枪反复吹打几次，使其完全溶解，获得的RNA溶液保存于-80℃待用。
RNA抽提的技巧：
1：快速阻止Rnase活性–样品收集后快速冷冻，裂解时快速操作灭活Rnase。
2：选择合适的抽提方法–高核酶含量的组织，脂肪组织最好用含苯fen 的方法。
3：预判质量要求– Northern，cDNA文库构建对完整性要求高，RT-PCR, RPA (Ribonuclease protection assay)对完整性要求不是很高。RT-PCR对纯度(酶抑制物残留)要求很高。
4：彻底匀浆是提高得率和降低降解的关键。
5：检查 RNA的完整性–电泳检测，28S:18S =2:1是完整的标志，1:1对大部分实验也是可以接受的。
6：去除DNA –用于RT-PCR, array analysis最好用Dnase I去除DNA。
7：降低外源酶的污染–不能从外面又导入酶。
8：低浓度的核酸浓缩时，要加入助沉淀试剂。但要防止助沉淀剂含酶及DNA污染。
9：彻底溶解RNA，必要时可以65C加热5分钟。
10：合适的保存方法–短时间可以–20C保存，长期请保存于–80C。