PCR反应检测过程注意事项

428 人阅读发布时间：2023-05-24 16:41

PCR技术的基本原理类似于DNA的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。

PCR由变性--退火--延伸三个基本反应步骤：

1、模板DNA的变性：模板DNA经加热至94℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应做准备；

2、模板DNA与引物的退火(复性)：模板DNA经加热变性成单链后，温度降至55℃左右，引物与模板DNA单链的互补序列配对结合；

3、引物的延伸：DNA模板--引物结合物在Taq酶的作用下，以dNTP为反应原料，靶序列为模板，按碱基配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板DNA 链互补的半保留复制链。

重复循环变性--退火--延伸三过程，就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需2～4分钟， 2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。PCR反应扩增出了高的拷贝数，下一步检测就成了关键。荧光素（溴化乙锭，EB）染色凝胶电泳是最常用的检测手段。电泳法检测特异性是不太高的，因此引物两聚体等非特异性的杂交体很容易引起误判。但因为其简捷易行，成为了主流检测方法。近年来以荧光探针为代表的检测方法，有逐渐取代电泳法的趋势。

注意事项：

1. 由于PCR反应灵敏度很高，因此要特别主意防止DNA污染的发生。样品间的相互污染可能产生假阳性结果，特别是将PCR技术应用到临床病原菌感染确定中。
2. 如果是公用的、没有密码保护的PCR仪，经常检查PCR仪上的程序正确与否。
3. 不使用过量试剂“less is usually better (more specific)”。
4. 试剂购回后应分装成小份使用，这样一旦有污染发生，可以立即丢弃污染的试剂，不会造成大的损失；试剂分装也有助于减少反复冻融次数（例如dNTPs对反复冻融敏感）。
5. 加完所有试剂后用枪头吹打几次或稍微涡旋或轻弹管壁以保证充分混匀。
6. 使用阴性对照检查污染的发生。
7. 使用阳性对照（能良好扩增的样本）。
8. 电泳时使用DNA分子量标准品（指示是否PCR失败或条带跑出凝胶或拍照系统失败）。
9. 当扩增很长的、GC含量高的模板时或容易产生二级结构的模板时适量使用添加剂（glycerol, formamide, NMP使变性和退火温度降低几度；glycerol也可起到稳定聚合酶活性的作用；DMSO 减少二级结构的发生，并通过减弱非特异性引物结合的稳定性，提高反应的特异性）。
10. 不使用带有自动除霜功能的冰箱存储酶（避免反复冻融），每次取酶时都使用新的枪头酶，酶使用后应立即放回冰箱。酶要在加完缓冲液后再加，直接将酶加入水中可能导致酶变性失活。
11. PCR产物的电泳检测时间，一般为48 h以内，有些最好于当日电泳检测，大于48h后带型不规则甚致消失。

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