PCR结果不满意参考建议

274 人阅读发布时间：2023-10-09 11:51

聚合酶链反应(PCR) 技术是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)及适当浓度的Mg2+存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。PCR结果总是不满意参考建议：

参考建议：

1、将PCR反应的试管与反应板紧贴。

2、当酶反应混合物以70℃“热启动”开始循环时，切记在加入酶后稍微振荡一下，因为在0.2-ml的PCR管中不能均匀传热。

3、不要随意减少dNTP的用量，它是一个系统的因素，必须与其它成份保持平衡。

4、对于有问题的PCR反应，例如模板的量少，模板不纯和环状模板等，先尝试加Taq酶前的体系进行预变性，后加模板进行正常PCR扩增。

5、没有扩增产物：在提供MgCl2缓冲液中，以0.25mmol/L为梯度增加MgCl2浓度；无MgCl2的缓冲液以0.5 mmol/L为梯度增加MgCl2浓度。

6、泳道中出现模糊条带，如果DNA模板中存在RNA，则按上述提示浓度补加MgCl2，因为在PCR反应中可能缺少游离的Mg2+。

7、检查退火温度和变性条件，如果有需要的话，可降低退火温度。

8、检查模板和引物的用量。

9、增加循环次数和/或模板DNA的用量。

10、泳道中出现模糊条带：减少循环次数或模板DNA的用量。提高退火温度，但不要超过68℃。重新设计引物或设计更长的引物。

11、建议使用0.2-ml薄壁管。厚壁管在92℃时不能有效地使模板变性。最佳反应体积为50ml，推荐用30ml矿物油覆盖（对盖子加热的PCR仪可以不加）。大多数反应中，0.75ml（0.5~1ml）的酶量在大多数情况下可以得到满意的结果。建议使用1.75mmol/L MgCl2∶350mmol/L dNTP或2.25mmol/L MgCl2∶500mmol/L dNTP组合的混合物。然而要得到最佳结果，优化Mg2+的浓度是必需的。

12、基因组DNA模板的质量显著影响PCR反应。因此推荐使用琼脂糖凝胶电泳来检测DNA的长度。DNA片段长度可以超过50kb，传统的基因组DNA能扩增片段至10kb。要扩增更长的片段应使用超纯或高分子量的DNA。请查阅高分子量DNA提取操作过程相关文献。降低二级结构和引物二聚物形成的可能性。进行长片段PCR扩增时，引物长度一般为24~34个核苷酸，溶点在60~68℃间。使用这类引物可提高PCR反应的退火温度来增加反应的特异性。这点非常重要，长片段扩增的效果往往受到非特异性短片段优先扩增的影响。

13、变性：第一步变性在94℃下进行2分钟。在循环过程中尽可能缩短变性时间（94℃下进行20--30秒），除非模板中富含GC，则95℃下变性30秒。这可以防止DNA脱嘌啉和链断裂，对于所需扩增的基因组DNA片段终长度超过12 kb时，应该尽可能的降低变性温度。

14、延伸：68--72℃下进行延伸操作。循环延伸：尽量采用循环延伸的条件，若PCR仪无此功能，则必须增加延伸的时间，例如在扩增10kb片断时，延伸时间用10分钟替代原来的8分钟。长片断PCR系统扩增的片断其3’-末端带有一个突出的A，因此建议采用T/A克隆。若要进行平端可隆，可用Klenow酶和T4 DNA多聚酶将PCR产物补平后再进行。测序时因酶的混合物带有3’→5’外切酶活性，用Sanger方法进行测序不能产生均一的（染色体）带型。

15、引物设计：一般长度20-30bp；至少50%的GC含量；避免引物二聚体和二级结构；引物对的Tm值应该接近。

　　经DEPC处理好的东西如EP管,剪刀等接下来该怎么办？是用双蒸水冲洗,还是用DEPC处理的水冲洗？

温馨提示：

　　经DEPC处理好的EP管,应该去高压，既灭菌又去除了DEPC，DEPC再没高压的情况下是有毒性的。剪刀等浸泡后用DEPC处理的水冲洗。

　　处理过程应该是这样的：在ddH2O中加入0.1％的DEPC，用搅拌子搅拌2小时，使DEPC充分溶解在水里。然后将EP管,tip头及大离心管etc浸入以上水中，后放入37度培养箱中过夜，第二天倒掉液体后高压。（不是仅仅DEPC处理的水冲洗就可以的）。DEPC处理的水不重复使用。

　　经DEPC处理好的东西如EP管,应先在70-80度烤干后，再高压剪刀玻璃制品可以用DEPC处理后180-200度干烤2小时。

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