细胞复苏过程及常见问题解决方案参考

2503 人阅读发布时间：2024-01-15 16:04

细胞复苏是指将冻存在液氮里边或者-80℃冰箱中的细胞解冻，再培养传代。细胞复苏应采用快速融化的方法，这样的目的是为了让细胞外结晶在很短的时间内融化，从而避免慢悠悠的融化，使得水分渗入细胞内再结晶，从而对细胞再次造成伤害，从而影响细胞的存活率。

细胞复苏过程：
1：细胞是冻在-80℃的环境里面的，所以拿出来后，应该尽快去37℃水浴锅里解冻（我一般是放在PE手套里面，然后在37摄氏度的水域上快速融化。）这一步的操作不要超过一分钟！
2：用预热的培养基稀释冻存的细胞（这步我会把融化的冻存液加入到15ml的管子里，加入3ml的预热的培养液，在超净台里完成）
3：离心200g 5-10min，具体的离心的时间不同的细胞略有不同得具体得看培养的protocol
4：在离心以后，倒掉上清（因为冻存液里用DMSO, 它的作用是在冻存细胞时加入，加入的量大概是总体积的10%，起到防冻剂的作用，防止冷冻过程中细胞内形成冰晶。）
5：用预热的培养液重悬细胞（根据培养的细胞皿的体积调整，我参照了GM12878,K562的培养protocol，刚开始的细胞密度不要超过10^6 /ML，但是细胞的密度也别太稀了，要不然长的会不好)
6：放到37℃，5%的二氧化碳培养箱中培养细胞。
PS：在看细胞冻存和复苏的时候，有一个词叫做“慢冻快融”，所以在解冻细胞的时候，在加入预热的培养基洗细胞之前，操作尽量的快，减少DMSO对细胞的伤害。我的冻存液的配方是：90%的FBS+10%的DMSO，冻存效果没问题！

问题解决方案：
1.取错细胞：
拿错冻存管。（快快快，匆忙之中，难免出错，况且－170多度，冻手！）
解决：
（1）核查记录册及冻存管上细胞的名称、时间是否一致。
（2）拿细胞时戴手套！

2.水浴时间太长：
2min还没融化。（冻存管的壁较厚，隔热）
解决：
（1）适当提高水浴温度（37度－40度）。
（2）要是冬天，就选用保温盒。

3.冰盒内时间太长：
复苏1h后，还没有加入新的培养液。（高浓度DMSO防止胞内形成冰晶，冻存时保护细胞，但复苏融解后，浸泡时间太久会，对细胞有毒性）
解决：提前预定超净台，减少复苏后插在冰盒里等待的时间。

4.失去耐心：
复苏三四天后，细胞没有任何动静，认为失败，倒掉所有细胞。（有些细胞复苏后一星期，才有起色）
解决：不要换液，耐心等待，两周后再做决定。

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