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逆转录（RT）实验操作步骤及问题解析
人阅读 发布时间：2024-04-07 11:32
逆转录（reverse transcription）实验作为是常见的分子生物学实验之一，逆转录过程遗传信息的流动方向为RNA到DNA，与转录过程DNA到RNA的方向相反，故称为逆转录。逆转录是以 RNA 为模板合成 DNA 的过程，即 RNA 指导下的 DNA 合成，逆转录实验包括3大要素，分别是引物、逆转录酶和 RNA 模板。
实验原理：
酶促催化使RNA反转录为cDNA第一链。一条寡聚脱氧核苷酸引物先与RNA杂交，然后由RNA依赖的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。依据实验的不同目的，针对cDNA第一链合成的引物可根据特殊的靶基因设计，或可用随机引物与所有mRNA杂交。
实验步骤：
1、试剂化冻后，用手轻弹混匀后短暂离心。
2、基因组DNA（gDNA）去除：根据RNA样品的浓度按10pg~1μg计算用量，在RNase-free离心管中依次加入RNase-free ddH2O，5×gDNA Wiper Mix 2μL，RNA样品，总体系为10μL。用移液器吹打混匀后短暂离心。放入PCR仪，设置反应条件为42℃ 2min。
3、 第一链cDNA合成：根据上一步反应管的数量按以下体系在RNase-free离心管中配制预混液：RNase-free ddH2O 5μL，逆转录引物（2μM）1μL，10×RT Mix 2μL，HiScript II Enzyme Mix 2μL，用移液器吹打混匀后短暂离心。在上一步得到的反应管中每管加入10μL，用移液器吹打混匀后短暂离心。放入PCR仪，设置反应条件为25℃ 5min，50℃ 15min，85℃ 5min。所得cDNA产物可立即用于qPCR反应或-20℃保存。
注意事项：
1. 防止RNase污染：保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase-free。
2. 反应液的配制要在冰上操作完成，防止温度过高造成RNA降解。
3. cDNA保存时避免反复冻融。
逆转录实验中实际操作时常出现问题如下：
1. 如何提高 RT-PCR 反应的灵敏度与特异性？
① 确定模板 RNA 完整性好，无 DNA 污染。
② RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂。
③ 使用适量的模板 RNA ，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
④ 若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。
2. RNA 中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？
逆转录抑制剂包括：SDS 、EDTA 、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐等等。可将已确定的高质量 RNA 模板同样品混合，同高质量 RNA 模板比较产量以检测 RNA 抑制剂；若高质量模板 RNA 与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对 RNA 沉淀进行清洗，以除去抑制剂。
3. 逆转录后的 qPCR 实验 Ct 值偏大或者普通 PCR 产量低。
① RNA 模板质量差，需要重新制备 RNA 模板，可通过琼脂糖凝胶电泳检测质量。
② 逆转录后的 cDNA 中含有高浓度的模板 RNA 和逆转录试剂成分，可能会对后续的PCR 产生抑制作用，所以可以适当梯度提高 cDNA 稀释比例（通常来说可将 cDNA 原液稀释5-10倍，其*佳模板加入量以扩增得到的 Ct 值在20-30个循环为好）。
③ 起始的 RNA 模板量低，需要减少稀释倍数或增加 RNA 模板量。
④ 基因本身原因（复杂和长度），可以重新设计复杂基因的引物，避免复杂结构。或者用三步法程序或延长两步法程序的延伸时间。
⑤ 逆转录或者定量产品性能差，可以通过做平行不用品牌产品对比实验，对比逆转录产品性能。
4. 逆转录酶扩增效率评估，应该关注哪些指标？
建议： qPCR-ct 值，或者 PCR 产量
如果想比较逆转录性能，尤为直接的还是后续做 qPCR 或者 PCR 平行对比实验，这种方法相对较为准确。
不建议：cDNA 中间产物浓度测定 or 其他方法。
逆转录完成后是不建议测定产物浓度的，由于逆转录后产生 RNA-cDNA 杂交链，溶液中的 RNA 和部分 DNA 会对吸光值产生影响，所以测定出来的产物浓度并不准确，即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的试剂盒进行对比实验，由于不同品牌之间的逆转录体系具有或多或少的差异，其体系中的各种离子等都能对吸光度产生影响，所以测定的结果也没有可比性。
优化及注意事项：
1、 逆转录 PCR 时，提取 RNA 是关键，需分离高质量 RNA（纯度和完整性）。
2、 整个操作过程需使用去 RNA 酶的枪头、EP 管等耗材。
3、 逆转录过程中要谨防 RNA 酶的污染，加入 RNA 酶抑制剂。
4、 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
5、 逆转录实验应全程在冰上操作完成，操作过程应避免 RNase 污染。
6、 提高逆转录预热温度（也可根据相应逆转录试剂盒进行调整）。
7、 减少基因组 DNA 污染，可使用去基因组的逆转录试剂盒。
实验原理：
酶促催化使RNA反转录为cDNA第一链。一条寡聚脱氧核苷酸引物先与RNA杂交，然后由RNA依赖的DNA聚合酶催化合成相应互补的cDNA拷贝，后者能进一步用于PCR扩增。依据实验的不同目的，针对cDNA第一链合成的引物可根据特殊的靶基因设计，或可用随机引物与所有mRNA杂交。
实验步骤：
1、试剂化冻后，用手轻弹混匀后短暂离心。
2、基因组DNA（gDNA）去除：根据RNA样品的浓度按10pg~1μg计算用量，在RNase-free离心管中依次加入RNase-free ddH2O，5×gDNA Wiper Mix 2μL，RNA样品，总体系为10μL。用移液器吹打混匀后短暂离心。放入PCR仪，设置反应条件为42℃ 2min。
3、 第一链cDNA合成：根据上一步反应管的数量按以下体系在RNase-free离心管中配制预混液：RNase-free ddH2O 5μL，逆转录引物（2μM）1μL，10×RT Mix 2μL，HiScript II Enzyme Mix 2μL，用移液器吹打混匀后短暂离心。在上一步得到的反应管中每管加入10μL，用移液器吹打混匀后短暂离心。放入PCR仪，设置反应条件为25℃ 5min，50℃ 15min，85℃ 5min。所得cDNA产物可立即用于qPCR反应或-20℃保存。
注意事项：
1. 防止RNase污染：保持实验区域洁净；操作时需穿戴干净的手套、口罩；实验所用的离心管、枪头等耗材均需保证RNase-free。
2. 反应液的配制要在冰上操作完成，防止温度过高造成RNA降解。
3. cDNA保存时避免反复冻融。
逆转录实验中实际操作时常出现问题如下：
1. 如何提高 RT-PCR 反应的灵敏度与特异性？
① 确定模板 RNA 完整性好，无 DNA 污染。
② RNA 模板中不应含有扩增反应抑制剂。
③ 使用适量的模板 RNA ，模板量太多会降低特异性，太少会导致扩增不出条带或条带太弱。
④ 若模板中有二级结构，可通过提高逆转录反应温度来提高扩增效果。
2. RNA 中含有逆转录抑制剂时，怎么处理？
逆转录抑制剂包括：SDS 、EDTA 、甘油、焦磷酸钠、亚精胺和胍盐等等。可将已确定的高质量 RNA 模板同样品混合，同高质量 RNA 模板比较产量以检测 RNA 抑制剂；若高质量模板 RNA 与样品混合后产量降低，则说明样品中存在逆转录抑制剂，可用70%（v/v）乙醇对 RNA 沉淀进行清洗，以除去抑制剂。
3. 逆转录后的 qPCR 实验 Ct 值偏大或者普通 PCR 产量低。
① RNA 模板质量差，需要重新制备 RNA 模板，可通过琼脂糖凝胶电泳检测质量。
② 逆转录后的 cDNA 中含有高浓度的模板 RNA 和逆转录试剂成分，可能会对后续的PCR 产生抑制作用，所以可以适当梯度提高 cDNA 稀释比例（通常来说可将 cDNA 原液稀释5-10倍，其*佳模板加入量以扩增得到的 Ct 值在20-30个循环为好）。
③ 起始的 RNA 模板量低，需要减少稀释倍数或增加 RNA 模板量。
④ 基因本身原因（复杂和长度），可以重新设计复杂基因的引物，避免复杂结构。或者用三步法程序或延长两步法程序的延伸时间。
⑤ 逆转录或者定量产品性能差，可以通过做平行不用品牌产品对比实验，对比逆转录产品性能。
4. 逆转录酶扩增效率评估，应该关注哪些指标？
建议： qPCR-ct 值，或者 PCR 产量
如果想比较逆转录性能，尤为直接的还是后续做 qPCR 或者 PCR 平行对比实验，这种方法相对较为准确。
不建议：cDNA 中间产物浓度测定 or 其他方法。
逆转录完成后是不建议测定产物浓度的，由于逆转录后产生 RNA-cDNA 杂交链，溶液中的 RNA 和部分 DNA 会对吸光值产生影响，所以测定出来的产物浓度并不准确，即使利用同一批次 RNA 和不同品牌的试剂盒进行对比实验，由于不同品牌之间的逆转录体系具有或多或少的差异，其体系中的各种离子等都能对吸光度产生影响，所以测定的结果也没有可比性。
优化及注意事项：
1、 逆转录 PCR 时，提取 RNA 是关键，需分离高质量 RNA（纯度和完整性）。
2、 整个操作过程需使用去 RNA 酶的枪头、EP 管等耗材。
3、 逆转录过程中要谨防 RNA 酶的污染，加入 RNA 酶抑制剂。
4、 为了防止非特异性扩增，必须设阴性对照。
5、 逆转录实验应全程在冰上操作完成，操作过程应避免 RNase 污染。
6、 提高逆转录预热温度（也可根据相应逆转录试剂盒进行调整）。
7、 减少基因组 DNA 污染，可使用去基因组的逆转录试剂盒。
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