荧光定量PCR反应操作技术全方面探究

241 人阅读发布时间：2024-08-20 16:32

一、荧光定量PCR原理　
荧光定量PCR(qPCR)是一种基于PCR反应的核酸定量技术，利用荧光染料或荧光探针来监测PCR反应过程中目标基因的扩增量，并通过荧光信号强度来定量目标基因的初始拷贝数。

PCR反应：
qPCR首先进行的是标准的PCR反应，即利用DNA聚合酶将目标基因片段进行指数扩增。
　　荧光检测：
　　荧光染料法：使用能够与双链DNA结合的荧光染料，如SYBRGreenI。当染料与双链DNA结合时，其荧光强度会增强，可以通过检测荧光信号强度的变化来监测PCR产物的累积。
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　　荧光探针法：使用特异性结合目标基因片段的荧光探针。探针通常包含一个报告荧光基团和一个淬灭荧光基团。当探针完整时，淬灭荧光基团抑制报告荧光基团的发光。当探针与目标基因结合后，DNA聚合酶会降解探针，分离报告荧光基团和淬灭荧光基团，导致荧光信号增强。
　　定量分析：
qPCR系统会实时监测荧光信号强度的变化，并绘制出荧光信号强度随循环次数变化的曲线，称为Ct值(Cyclethreshold)。Ct值是指荧光信号强度超过预设阈值的循环次数。Ct值越小，表示目标基因的初始拷贝数越多。

二、荧光定量PCR操作技术
1、实验准备：
　　试剂准备
qPCR试剂盒：包含TaqDNA聚合酶、dNTP、缓冲液、荧光染料/探针等。
　　模板DNA：通常是提取的RNA反转录得到的cDNA。
　　引物：与目标基因片段两端序列互补的寡核苷酸。
2、仪器准备：
　　实时荧光定量PCR仪：用来进行PCR反应并实时检测荧光信号。
　　移液器：用于精准移取试剂。
　　其他材料：无菌离心管、微量移液管、EP管、移液器枪头等。
3、操作步骤：
1）、配制反应体系：根据试剂盒说明书，将所需的试剂（如PCR反应缓冲液、Taq酶、dNTP、引物、模板DNA和荧光染料/探针）混合在一起，配制反应体系。
2）、加样：将配制好的反应体系加入qPCR仪的反应管或反应板中。
3)、运行程序：在qPCR仪上设置相应的程序，包括温度梯度、循环次数、荧光检测等参数。
4）、数据分析：运行结束后，qPCR仪会自动收集荧光数据并进行分析，绘制出Ct值曲线，并计算目标基因的相对或绝对含量。

三、荧光定量PCR仪器类型
　　目前市面上常见的荧光定量PCR仪器主要有以下几种：
1、单通道荧光定量PCR仪：只有一个荧光通道，只能使用一种荧光染料或探针。
2、多通道荧光定量PCR仪：具有多个荧光通道，可以同时使用多种荧光染料或探针，进行多重检测。
3、数字PCR仪：将反应体系分成大量的微反应单元，对每个单元进行独立的PCR反应，可以提高检测灵敏度和准确性。

四、注意事项
1、严格进行无菌操作，避免污染。
2、准确配制反应体系，避免试剂浓度误差。
3、仔细设置qPCR程序，包括温度梯度、循环次数、荧光检测等参数。
4、使用合适的内参基因进行标准化，以消除不同样本间差异带来的影响。
5、合理分析实验结果，避免误判。

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