聚合酶链式反应(PCR)反应DNA体外复制解读

聚合酶链式反应(Polymerase Chain Reaction)，简称 PCR，是一种分子生物学技术，用于放大特定的 DNA 片段。

PCR 由变性--退火--延伸三个基本反应步骤构成：

1、模板 DNA 的变性：模板DNA经加热至93℃左右一定时间后，使模板DNA双链或经PCR扩增形成的双链DNA解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；

2、模板 DNA 与引物的退火(复性)：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55℃左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；

3、引物的延伸：DNA 模板--引物结合物在 TaqDNA 聚合酶的作用下，以dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链，重复循环变性--退火--延伸三过程就可获得更多的“半保留复制链”，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟，2～3小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

 聚合酶链反应(PCR)技术是在体外进行的由引物介导的酶促DNA扩增反应。PCR的原理是在模板DNA、PCR引物、四种脱氧核糖核苷酸(dNTP)及适当浓度的Mg2+存在的条件下，依赖于DNA聚合酶的体外酶促合成反应。 PCR是以DNA半保留复制机制为基础，发展出的体外酶促合成、扩增特定核酸片段的一种方法。

一、模板和底物

DNA复制是模板依赖性的，必须以亲代DNA链作为模板，亲代DNA的两股链解开后，可分别作为模板进行复制。同时，DNA复制需要以四种脱氧核糖核苷酸，即dATP、dGTP、dCTP、dTTP，为底物合成子代DNA。

在体外进行DNA复制时，模板和底物均可通过人工添加解决。

二、引物

DNA聚合酶必须以一段具有3’端自由羟基（3’-OH）的RNA作为引物，才能开始合成子代DNA链。

在体外进行DNA复制时，可以人工合成具有特定序列的寡核苷酸作为引物，该引物序列与进行扩增的目的核酸片段互补匹配，从而开始目的片段的扩增。

因为引物的碱基序列需要与目的片段相匹配，在合成引物之前，必须首先已知目的片段的碱基序列，至少也要知道目的片段的部分序列，从而确定合成引物的碱基序列。

三、模板双链的解旋

在DNA的半保留复制机制中，双链DNA的解旋是在拓扑异构酶和解链酶的作用下完成的，该过程需要拓扑异构酶识别DNA的复制起点才能开启，而体外扩增特定的核酸片段只需要特异性的复制目的核酸片段，因而需要一种方式使得模板DNA解旋为单链DNA，之后在使之与引物结合，从而特异性的扩增目的核酸片段。

三、DNA的变性

DNA变性是指核酸双螺旋结构中碱基对的氢键断裂，使得双链变为单链的过程。

对双链DNA进行加热可以使其发生变性，当温度升高到一定高度时，DNA在260nm处的吸光度会突然发生明显的上升，并达到最大值，之后温度继续上升，其吸光度也不会发生明显变化，若以温度对DNA溶液的260nm吸光度做图，会得到典型的DNA变性S型曲线。

DNA的变性是在一个很窄的温度范围内发生的，通常将核酸加热变性过程中，紫外光吸收值达到最大值50%时的温度称为核酸的熔解温度 (Tm, melting temperature)。

1. 特定核酸分子的Tm值与其G+C含量成正相关，GC% = (Tm-69.3) × 2.44；

2. Tm值的大小还与核酸分子的长度有关，核酸分子越长，Tm值越大；

3. 粒子强度越高，熔解温度越高，熔解温度范围越窄。

四、DNA的复性

加热变性的DNA在缓慢冷却后可以由单链恢复为双链结构，这一过程称为DNA的复性，也称为“退火 (annealing)"。

当温度降低至比变性DNA的Tm低25℃时，其复性效果*佳，越远离此温度，复性效果越差。

因此，可以利用此特性，在加热使模板DNA变性后，将温度降低至特定温度，从而使所加引物与模板DNA复性结合，进而能够对引物所规定的核酸片段进行特异性的扩增。

五、DNA聚合酶

为了使模板中特定的核酸片段进行扩增，在模板与引物结合后，需要有DNA聚合酶的参与，但是由于DNA变性和复性过程的温度较高，普通的DNA聚合酶在此过程中会由于温度过高而失活。

科学家为了解决该问题，从水生栖热菌 (Thermus Aquaticus) 中分离出了具有热稳定性的DNA聚合酶，该酶可以耐受90℃以上的高温而不失活。