冰冻切片（Frozen Section）实验技术指导

  冰冻切片（Frozen Section）是一种在低温条件下，将组织快速冷却到一定硬度，然后进行切片的方法。可以说是进入一种生物组织微观世界的门户，同时也是医学诊断的得力助手。
   当前，基于扫描电镜的大体积电子显微镜技术上突破性的进展， 使得样品的三维可视化可以看到前所未you的细节，随着诸多解决方案的发展，比如阵列式断层扫描成像（Array Tomography，AT），连续切面成像（Serial Block Face Imaging, SBFI）和聚焦离子束（Focused IonBeam，FIB） 扫描电子显微镜，使得以前属于专家领域的连续切面技术正在变得越来越自动化。这些变化正在迅速扩大三维电子显微镜技术在农学和生物医学研究领域的应用范围。在三维空间中获取具有超微结构细节的综合功能信息将成为常规。
    目前该技术已成功应用于神经生物学中大脑链接以及阿尔兹海默症、癫痫和帕金森等神经系统疾病中脑组织在亚细胞水平的三维结构分析；基础医学研究中乳腺癌、甲状腺癌等癌细胞的三维结构分析，线虫及昆虫等超大尺度样品的纳米水平三维结构分析，以及病毒在细胞内组装和细胞间转移等过程的机制研究。
   实验方法原理：冰冻切片是指将组织在冷冻状态下直接用切片机切片。它实际上是以水为包埋剂，将组织进行冰冻至坚硬后切片的。在冰冻切片前组织不经过任何化学药品处理或加热过程，大大缩短了制片时间。同时，由于此法不需要经过脱水、透明和浸蜡等步骤，因而较适合于脂肪、神经组织和一些组织化学的制片，并作为快速切片的方法应用在临床诊断。
实验步骤：
一、取材
应尽可能快地采取新鲜的材料，防止组织发生死后变化。
二、速冻
1、将组织块平放于软塑瓶盖或特制小盒内（直径约2cm）。
2、如组织块小可适量加OCT包埋剂浸没组织，然后将特制小盒缓缓平放入盛有液氮的小杯内。
3、当盒底部接触液氮时即开始气化沸腾，此时小盒保持原位切勿浸入液氮中，大约10-20s组织即迅速冰结成块。
4、在制成冻块后，即可置入恒冷箱切片机冰冻切片。
5、若需要保存，应快速以铝箔或塑料薄膜封包，立即置入-80℃冰箱贮存备用。
三、固定
1、样品托上涂一层OCT包埋胶，将速冻组织置于其上，4℃冰箱预冷5-10min让OCT胶浸透组织。
2、取下组织置于锡箔或者玻片上，样品托速冻。
3、组织置于样品托上，其上再添一层OCT胶，以完全覆盖为宜，速冻架（PE）上30min。
四、切片
1、恒温冰冻切片机为较理想的冰冻切片机，其基本结构是将切片机置于低温密闭室内，故切片时不受外界温度和环境影响，可连续切薄片至5-10μm。
2、切片时，低温室内温度以-15℃ ~ -20℃为宜，温度过低组织易破碎，抗卷板的位置及角度要适当，载玻片附贴组织切片，切勿上下移动。
3、切好室温放置30min后，入4℃丙酮固定5-10min，烘箱干燥20min。PBS洗5min×3。
4、进行抗原热修复，微波热修复也可，室温自然冷却。可用3%H2O2孵育5-10min，消除内源性过氧化物酶的活性。
五、免疫荧光染色
1、冰冻切片室温晾干15min，可用含10%正常山羊血清的PBS室温封闭切片1小时（此步可不洗）。
2、滴加适当比例稀释的一抗或一抗工作液（抗体的量视组织大小而定，原则是可以均匀覆盖组织面，且保证整个过程中不会使组织干涸）。
3、将切片放在加了PBS的免疫组化湿盒，室温孵育2小时或4℃过夜。
4、第二天先将湿盒放到37℃回温1h，然后吸取片上的一抗进行回收，将切片插入到小染缸PBS冲洗。
5、滴加用PBS稀释好的二抗（避光）置于分子杂交箱中37℃孵育1小时。回收二抗，切片置于染缸内，PBS洗5min×3次。
6、滴加DAPI工作液染核，室温10-20min（工作浓度0.1%染色15min）。
7、回收DAPI，滴加5-10μl抗荧光衰减封片剂或中性树胶，用处理干净的盖玻片封片，即可到荧光显微镜或者共聚焦显微镜下观察拍照。
8、做好的切片放在切片盒内，置于4℃冰箱，可保存一周左右。