ELISA双抗体夹心法检测抗原优缺点及操作步骤

ELISA实验的原理:
包被：抗原或者抗体能以物理性吸附于固相载体表面，原因是蛋白质和(C8H8)n表面间的疏水性部分相互吸附，吸附之后能保持抗原反应等免疫活性。
标记：抗原或者抗体可通过共价键与酶连接成酶结合物而此种酶结合物仍能保持其免疫活性和酶的催化特点。
显色：酶结合物与相应包被在固相载体的抗原或抗体结合后，也被固定在固相载体上，加入酶的底物之后可出现显色反应，根据反应的颜色深浅可计算抗原或者抗体的相对含量。

双抗体夹心法的优点： 
1.特异性高：使用两种针对同一抗原不同表位的抗体，减少了非特异性结合的干扰，检测结果的特异性较强。 
2. 灵敏度高：能检测到低浓度的抗原，适用于微量抗原的检测。 
3. 准确性好：重复性和准确性相对较高。 

 双抗体夹心法的缺点： 
1.对抗体的要求高：需要制备和获得两种高质量、特异性强且亲和力高的抗体，这增加了实验的难度和成本。
2. 检测范围较窄：可能不适合检测浓度过高的抗原，容易出现“钩状效应”，即抗原浓度过高时检测信号反而下降。 
3. 不能检测半抗原：由于半抗原通常只有一个抗原决定簇，无法被两种抗体同时结合，所以该方法不适用于半抗原的检测。

ELISA双抗体夹心法检测抗原的操作步骤：
1、包被抗体：将特异性抗体（捕获抗体）包被在固相载体（如酶标板）表面，通常在 4℃ 过夜，使抗体通过物理吸附固定在固相表面。
2、封闭：用封闭液（如 1% - 5% 的牛血清白蛋白溶液）封闭固相载体表面未被抗体占据的位点，以减少后续检测中的非特异性结合。在 37℃ 孵育 1 - 2 小时。
3、加样：将待测样品加入到已包被和封闭好的固相载体孔中，在 37℃ 孵育一定时间，使样品中的抗原与固相载体上的捕获抗体结合。
4、洗涤：用洗涤液洗去未结合的物质，重复多次以确保洗干净。
5、加检测抗体（酶标抗体）：加入酶标记的特异性抗体（检测抗体），该抗体能识别结合在捕获抗体上的抗原的另一个表位。在 37℃ 孵育一定时间，使检测抗体与抗原结合，形成“捕获抗体 - 抗原 - 酶标检测抗体”复合物。
6、洗涤：再次用洗涤液洗去未结合的酶标检测抗体。
7、显色：加入酶的底物溶液，孵育一段时间，酶催化底物产生显色反应。
8、终止反应：加入终止液终止显色反应。
9、结果测定：使用酶标仪在特定波长下测定各孔的吸光度值。根据标准曲线计算出样品中抗原的含量。