实时荧光定量PCR（qPCR）检测和定量方法的特性

315 人阅读发布时间：2025-05-07 11:14

实时荧光定量PCR（qPCR）主要使用两种方法来检测和定量PCR产物：荧光探针法和荧光染料法。这两种方法各有特点，适用于不同的实验需求。
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一、 荧光染料法（如SYBR Green I）
原理：SYBR Green I是一种荧光染料，它可以与所有双链DNA结合，并且在结合后发出荧光。游离状态下的SYBR Green I几乎不发光，但一旦与双链DNA结合，荧光信号就会显著增强。
优点：
   简便快捷，不需要设计复杂的荧光探针。
   成本较低，因为不需要合成特异性探针。
   可以用于检测任何双链DNA序列的扩增，没有引物特异性限制。
缺点：

缺乏特异性，可能会与非特异性扩增产物结合，导致假阳性结果。
需要进行熔解曲线分析来区分特异性与非特异性产物。
灵敏度相对较低，容易受到引物二聚体的影响。

二、荧光探针法（如TaqMan探针）
原理：TaqMan探针是一种荧光探针，其两端分别标记有一个荧光报告基团（Reporter）和一个淬灭基团（Quencher）。探针完整时，报告基团的荧光被淬灭基团吸收。当PCR扩增过程中，Taq酶的5'外切酶活性将探针切割，导致报告基团和淬灭基团分离，荧光信号释放，荧光强度与扩增产物量成正比。
优点：

高特异性，只有与目标序列特异性结合的探针才会被切割，从而发出荧光。
灵敏度高，可以检测到低拷贝数的样品。
可以进行多重检测，通过使用不同波长的荧光报告基团，可以在同一反应中同时检测多个目标基因。

缺点：

需要为每个目标基因设计特异性的探针，增加了实验设计的复杂性和成本。
探针合成成本较高。
淬灭基团的完全淬灭有时难以实现，可能会影响信号的背景。

适用场景：

荧光染料法适用于快速筛查和差异表达分析，如基因表达研究、RNA干扰效果确认等，但需要后续的熔解曲线分析来验证特异性。
荧光探针法适用于对特异性要求较高的实验，如病原体检测、病毒定量、基因拷贝数测定等，以及需要进行多重检测的场景。

总结：
荧光染料法和荧光探针法各有优势和局限性，选择哪种方法取决于实验的具体需求，包括成本、特异性要求、检测的灵敏度以及是否需要多重检测等。在实际应用中，研究人员会根据实验目的和条件来选择最合适的qPCR方法。

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