荧光定量PCR（qPCR）的基本步骤

499 人阅读发布时间：2025-07-21 16:19

荧光定量PCR（qPCR）是一种用于定量检测DNA或RNA的方法，它通过在PCR扩增过程中实时监测荧光信号来确定目标分子的量。以下是进行荧光定量PCR的基本步骤：
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1. 样品准备
首先，需要准备含有目标核酸的样品，如RNA或DNA。这可能涉及从细胞或组织中提取总RNA，然后通过逆转录反应将其转化为cDNA。
2. 总RNA提取
对于RNA样本，首先使用TRIZOL或RNA提取试剂盒提取总RNA。这通常包括：
细胞裂解：使用TRIZOL或细胞裂解液处理细胞或组织，使RNA从细胞中释放。
两相分离：加入CHCl₃后，通过离心将样本分成有机相和水相，RNA位于水相中。
RNA沉淀：通过异丙醇沉淀RNA，然后用75%乙醇清洗以去除杂质。
RNA溶解：将RNA沉淀溶解在无RNA酶的水中。
3. RNA质量检测
使用分光光度计或琼脂糖凝胶电泳检测RNA的浓度和纯度，A260/A280比值应在1.8到2.1之间，表明RNA纯度较高。
4. 逆转录（RT）
使用逆转录酶将RNA转化为cDNA，这是RNA定量PCR的第一步。这通常涉及：
模板准备：取适量RNA，加入引物、dNTPs、缓冲液和逆转录酶。
反应条件：在特定温度下进行逆转录反应，如65°C保温5分钟，然后冷却至室温，再在42°C保温60分钟。
5. 引物设计
设计特异性引物，用于扩增目标基因。引物应遵循设计原则，如长度、GC含量和二级结构的避免等。
6. qPCR反应体系配制
根据所使用的荧光染料或探针类型，配制qPCR反应体系。这包括：
SYBR Green：加入SYBR Green染料、上游引物、下游引物、dNTPs、Taq酶和cDNA模板。
荧光探针：如果使用，还需加入特异性荧光探针。
7. 反应条件设置
设置qPCR仪的反应条件，包括：
预变性：93-95°C，2分钟，使模板DNA变性。
循环步骤：每个循环包括93-95°C变性、55-60°C退火、72°C延伸。
循环数：通常进行40个循环。
熔解曲线分析：循环后，从60°C开始，以0.5°C/分钟升至95°C，收集荧光数据，以验证扩增产物的特异性。
8. 数据分析
使用软件分析qPCR数据，计算Ct值（阈值循环数），并根据标准曲线进行定量分析。Ct值越低，表示初始模板量越高。
9. 质量控制
设置无模板对照（NTC）和阳性对照，确保实验的准确性和可靠性。
10. 结果验证
通过熔解曲线分析，确保扩增产物的特异性，避免非特异性扩增和引物二聚体的形成。
11. 数据处理
根据实验目的，使用绝对定量或相对定量方法分析数据。绝对定量用于直接测定样本中的核酸拷贝数，而相对定量则用于比较不同样本之间的表达差异。
12. 结果报告
记录实验条件、仪器设置、样品信息和分析结果，确保数据的可追溯性和重复性。
通过以上步骤，可以进行高效的荧光定量PCR实验，用于基因表达分析、病原体检测等多种生物学研究中。

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