褪黑素(Melatonin, MT)ELISA试剂盒在检测褪黑素水平时可能会遇到一些常见问题。这些问题及其解决方案包括:
一、标准曲线无梯度或显色异常
1、可能原因:
试剂未充分回温或孵育时间不足。
洗涤不彻底导致背景信号过高。
底物溶液变质(如TMB变蓝)或显色时间过长。
2、解决方案:
确保试剂平衡至室温,严格按说明书控制孵育时间。
增加洗涤次数(建议3次以上),使用洗板机时加入30秒浸泡步骤。
检查底物颜色,若异常需更换新试剂。
二、背景高或假阳性:
1、可能原因:
加样或加酶时污染,操作不规范。
2、解决方案:
更换枪头,确保吸头不接触标本,操作时注意避免交叉污染。控制恒温箱温度稳定在37℃±0.5℃,缩短操作时间以减少反应时间差异。
三、阴性样本显色过强(假阳性)
1、可能原因:
试剂污染(如显色液B液或标准品被污染)。
孵育温度过高或时间过长导致非特异性结合。
2、解决方案:
检查试剂是否混用其他批次,避免污染。
控制孵育温度(37℃±1℃)和时间,夏季注意恒温箱校准。
四、白板现象:
1、可能原因:
忘记加酶或显色液。
2、解决方案:
严格按照说明书操作,避免混淆试剂。
五、标曲有值样本无值:
1、可能原因:
样本中目标蛋白含量极低。
2、解决方案:
分析标准曲线,确认ELISA试剂盒品质,若正常则考虑样本中目标蛋白表达量。
六、样本浓度超出检测范围
1、可能原因:
样本未稀释或稀释比例错误。
2、解决方案:
若样本值高于最高标准品浓度,用PBS(pH 7.4)稀释后复测。
七、交叉反应干扰
1、可能原因:
抗体特异性不足(如多克隆抗体易结合类似结构物)。
样本含异嗜抗体或其他干扰物。
2、解决方案:
选择高特异性单克隆抗体试剂盒。
优化封闭步骤(如改用酪蛋白封闭剂)。
八、酶标仪读值偏低
1、可能原因:
滤光片选择错误(TMB底物需450nm波长)。
显色时间不足或终止液加样顺序错误。
2、解决方案:
校准酶标仪波长,确保使用450nm主波长和630nm参考波长。
显色后10-20分钟内终止反应,避免延迟。
通过这些解决方案,可以有效避免褪黑素ELISA试剂盒在实验中遇到的问题,提高检测的准确性和可靠性。