ELISA对照结果异常？教你一步步排查问题

在ELISA实验中，阳性对照、阴性对照和空白对照是评估实验系统是否正常运行的关键。若这些对照出现异常，可能导致假阳性或假阴性结果，影响数据可靠性。根据搜索结果，常见的对照异常包括“白板”（无显色）、“高背景”（非特异性显色）以及“阴性对照OD值过高”等现象。

常见ELISA对照异常类型与原因分析

一、白板（所有孔均无显色）

指实验结束后，包括阳性对照在内的所有孔都没有颜色变化。

可能原因	具体说明	解决方案
试剂过期或混用	使用了过期的酶标抗体或底物；不同批号/品牌的试剂混用导致反应失效	检查所有试剂的有效期和批号，确保来自同一试剂盒，不混用
漏加关键试剂	遗漏添加底物、显色剂A/B或酶标抗体	严格按照说明书操作流程核对每一步，加样后观察液面高度一致性
酶失活	酶标物受叠氮钠污染或保存不当失活	确保洗液容器不含酶抑制剂（如NaN₃），使用前试剂平衡至室温

二、高背景 / 阴性对照OD值过高

整板显色均匀或阴性对照OD值显著高于预期，可能造成假阳性判断。

可能原因：

封闭不充分：未有效阻断非特异性结合位点。

抗体浓度过高：一抗或二抗浓度过高导致交叉反应。

洗涤不彻底：残留未结合物质引发非特异信号。

标本中含有干扰物质：如类风湿因子（RF）、补体、异嗜性抗体等内源性干扰物可引起桥联反应，导致假阳性。

容器污染：盛放显色剂的容器被污染或吸头重复使用导致交叉污染。

解决方案：

优化封闭条件：更换封闭剂（如BSA、脱脂奶粉）并延长封闭时间至1–2小时。

调整抗体浓度：通过棋盘滴定法确定最佳稀释比例。

加强洗涤：严格按照说明书控制洗板次数、力度和浸泡时间。

处理样本干扰：对含RF样本进行热处理（56°C, 30min）灭活补体或使用变性IgG预封闭。

注：例如有用户报告间接ELISA中多个阴性血清样本OD值异常偏高，即使更换封闭液也无法改善，提示可能存在个体差异或未知干扰因素。

三、阳性对照不显色或显色弱

阳性对照应呈现明显显色，若其信号弱或缺失，提示检测系统灵敏度不足。

可能原因：

孵育温度/时间不足：未达到要求的反应条件（如37°C, 30–60分钟）。

标准品降解：反复冻融或长期存放于2–8°C导致活性下降。

仪器设置错误：酶标仪滤光片波长未设为450nm或光源异常。

建议措施：

1、所有试剂和样本使用前平衡至室温约20分钟。

2、标准品小量分装，避免反复冻融，长期保存于-20℃以下。

3、实验前检查酶标仪状态，确认波长和滤光片匹配。

ELISA对照异常可通过规范操作、合理设置对照和排除干扰因素来预防与纠正。关键在于：

l 严格遵循试剂盒说明书；

l 使用新鲜、合格的试剂并避免混用；

l 控制孵育温度与时间；

l 设置有效的阳性和阴性对照以监控实验质量。

若问题持续存在，建议更换新批次试剂或采用不同检测方法（如Western blot）进行验证。