减少ELISA标准品稀释误差的实用技巧有哪些？

在ELISA实验中，标准品用于构建标准曲线，是定量检测样本浓度的基准。若稀释过程出现误差，会导致标准曲线偏离真实值，进而使所有样本的检测结果失准。因此，控制稀释误差对保证实验的准确性与可重复性至关重要。

操作要点

一、耗材与试剂准备

使用经过校准的移液器和无菌、低吸附的吸头，避免因设备不准或液体挂壁引入体积误差。

准备足够数量的洁净EP管（建议硅化处理以减少蛋白吸附），并提前编号（如S0-S6）。

确保使用说明书指定的标准品稀释液（如1×PBS或专用缓冲液），不同样本类型可能需不同稀释液（如细胞上清可用培养基）。

二、标准品活化与初始溶解

冻干标准品使用前应短暂离心，使粉末沉底；按说明书加入指定体积溶剂（如200 μL蒸馏水），涡旋混匀5秒后静置10–30分钟至完全溶解。

溶解后可短暂离心收集管壁液体，确保浓度准确。

三、梯度稀释规范操作

推荐采用“系列稀释法”：先在各管中加入等体积稀释液，再从高浓度向低浓度逐级转移并混匀。

每次转移后必须充分混匀，推荐使用涡旋振荡器5秒以上，避免仅靠移液器吹打导致混合不均。

严禁直接在酶标板孔内进行倍比稀释，此做法易造成交叉污染和浓度偏差，应在离心管中完成后再加样。

对于大比例稀释（如200倍），建议分步进行（如先10倍再20倍），降低单步误差累积。

四、防止人为与系统误差

所有稀释步骤尽量由同一人完成，保持操作一致性。

避免反复冻融标准品溶液，建议一次性分装后储存于-20℃或-70℃。

使用排枪或自动移液系统可显著减少手工操作差异，提高重复性。

结论

为最大限度减小ELISA标准品稀释误差，应做到：提前规划稀释方案、使用经校准的工具、严格执行梯度稀释流程、每步充分混匀且不在反应孔内直接稀释。此外，每次实验都应同步绘制标准曲线，以实时监控稀释质量。