抗体开展 IP、Co-IP 实验有哪些核心操作要点

做免疫沉淀（IP）、免疫共沉淀（Co-IP）实验的关键注意点可以分为‌样本制备、抗体选择、孵育结合、洗涤洗脱、结果验证五个核心环节，每个环节的细节直接决定实验成败，详细注意事项如下：

一、样本制备环节：保证蛋白完整性与天然构象

1、避免蛋白提取条件适配‌

全程低温操作：样本取出后立即置于冰上，提取缓冲液提前预冷，加入蛋白酶抑制剂（PMSF、蛋白酶抑制剂cocktail），磷酸化蛋白IP还需加磷酸酶抑制剂，防止蛋白降解或去磷酸化，避免目标蛋白降解会直接导致沉淀失败。

温和裂解避免过度处理：核蛋白、膜蛋白需要选用对应强裂解强度的裂解液，可溶性胞浆蛋白用温和裂解液即可；超声破碎时控制功率和时间，避免超声产热导致蛋白变性，同时避免将蛋白聚集变性，打断蛋白之间的相互作用。

去除细胞/组织碎片，裂解后需4℃12000-14000rpm离心15-20分钟，取上清弃沉淀，碎片残留会导致非特异性结合增加，背景变脏。

Co-IP样本不能提前测蛋白浓度，保证总蛋白上样量控制在500μg-1mg，保证足够量不足会导致结果信号弱，过量会增加非特异性结合。

2、保持蛋白互作的天然状态‌

Co-IP实验禁止使用SDS、脱氧胆酸钠等强变性剂，不能煮沸变性会破坏蛋白间的非共价相互作用，仅可使用NP-40、Triton X-100等非变性去污剂，保证蛋白互作保留天然构象。

样本避免反复冻融，反复冻融会导致蛋白聚集、互作复合物解离，建议分装后-80℃保存，一次使用一份。

二、抗体选择与预处理：决定沉淀特异性的核心

1、抗体类型选择适配实验‌

IP首要选‌则亲和纯化的多克隆抗体‌或‌IP/Co-IP验证过的单克隆抗体‌：普通WB验证合格的抗体不一定适合IP，优先选择明确标注可用于IP/Co-IP的抗体。

标签蛋白IP（如Flag、HA、Myc标签）优先选择标签特异性磁珠偶联抗体，直接偶联抗体特异性更高、背景更低；内源性IP需要选择高特异性的一抗。

Co-IP实验不建议选择偶联了HRP、生物素等标记的抗体，标记基团可能会影响抗原结合位点，影响结合效率。

2、减少非特异性结合预清除步骤‌

正式IP前需要做预清除：将裂解液先与IgG同型对照抗体+琼脂糖/磁珠共同孵育30分钟，离心去除磁珠，去除与抗体、磁珠非特异性结合的杂蛋白，显著降低实验背景。

抗体用量控制：1mg总蛋白一般用1-2μg抗体，过量抗体会导致非特异性结合增加，过少则沉淀信号不足，不同抗体需要预实验优化用量。

三、结合与孵育环节：保证特异性结合效率

珠子选择与处理‌

Protein A/G磁珠/琼脂糖优先选择磁珠，磁珠操作更简便、背景更低，若使用琼脂糖需要提前用裂解液平衡三次，避免保存液中的杂质带入体系。

孵育时全程4℃旋转孵育，结合时间建议过夜结合，室温孵育会增加非特异性结合，室温会导致蛋白酶活性升高，降解目标蛋白；一般孵育4-6小时或过夜即可，过长孵育不会增加特异性结合，反而增加背景。

Co-IP孵育体系避免盐浓度过高，低盐缓冲液，盐浓度超过0.5M会破坏蛋白间静电相互作用，导致复合物解离，一般NaCl浓度控制在150mM-300mM最佳。

四、洗涤与洗脱环节：去除非特异性结合关键

洗涤条件优化‌

洗涤次数一般3-5次，每次洗涤用预冷的裂解液或清洗缓冲液（PBS添加0.1%Triton X-100，提高洗涤强度，增加盐浓度可有效洗去杂蛋白：

非特异性结合高时可适当提高盐浓度至200mM-500mM，同时增加洗涤次数1-2次；但过度洗涤会洗去特异性结合的蛋白，导致信号变弱，需要平衡洗涤强度。

每次洗涤充分重悬磁珠/琼脂糖，充分接触缓冲液，不要残留未结合的杂蛋白充分去除，避免倾倒洗涤，残留未充分，背景变脏。

洗脱条件选择‌

IP: 用2×SDS上样缓冲液，煮沸5分钟，充分洗脱结合蛋白，可以直接进行WB检测；若需要保留蛋白活性，可改用酸性洗脱缓冲液（0.1M甘氨酸pH2.5-3.0）洗脱后立即用中性缓冲液中和，适合后续质谱检测。

标签蛋白IP可以用过量标签肽竞争洗脱，纯度更高，适合Co-IP检测互作蛋白时背景更低。

五、对照设置与结果验证：排除假阳性，保证结果可靠性

必须设置的对照排除假阳性‌

阴性对照：同型IgG替代目标一抗，同型IgG相同浓度孵育沉淀，如果阴性对照也出现目标条带，说明是非特异性结合导致假阳性。

Input对照：上样前取10%的裂解液，证明目标蛋白确实存在于样本中，排除样本本身没有目标蛋白导致假阴性。

Co-IP必须设置阴性靶蛋白对照，，比如不表达目标蛋白的样本，验证互作，确认结合是否为非特异性。

结果验证注意‌

沉淀产物需要同时检测靶蛋白和互作蛋白的WB验证，仅检测互作蛋白的时候，同时排除抗体重链轻链的干扰：一抗来自小鼠IP产物的重链会在50kD左右，轻链在25kD左右，如果检测分子量接近的靶蛋白会干扰信号，可以选用HRP标记的轻链特异性二抗，或者交联固定抗体的方法去除干扰。

Co-IP结果需要做反向Co-IP验证，证明两个蛋白确实在体内存在相互作用，排除单次实验假阳性。

其他通用注意事项

避免污染：所有枪头、离心管都需要无菌无酶操作，避免蛋白酶降解蛋白；

新手建议设置预实验优化条件，尤其是不同靶蛋白的最佳抗体用量、洗涤强度都需要调整，一次实验才能拿到理想结果。