蔓荆子黄素对小鼠单核巨噬细胞影响的材料与方法

1.1.1药品与试剂 ICR 小鼠 2 只，雄性，8 ～ 10 周龄，体重 30~40 g，购自北京维通利华实验动物技术有限公司 ；RAW264.7 小鼠单核巨噬细胞株由北京中医药大学生命科学学院郝钰教授馈赠，DMEM 培养基为 Hy Clone 公司产品，胎牛血清（fetal bovine serum,FBS）、青链霉素混合液、胰蛋白酶消化液（0.25%trypsin-EDTA）均为 Gibco 公司产品，蔓荆子黄素（vitexicarpin）购自上海源叶生物科技有限公司，二甲基亚砜（dimethyl sulfoxide, DMSO）、无水乙醇（ethanol）购自国药集团化学试剂有限公司，磷酸盐缓冲液（phosphate buffered saline, PBS） 购 自 Solarbio 公 司，CCK-8（cell counting kit-8）试剂盒购自东仁化学科技（上海有限公司，活性氧（reactive oxygen species,ROS）检测试剂盒购自上海碧云天生物技术有限公司，碘化丙啶（propidium iodide, PI）、溴化乙锭（ethidiumbromide, EB）为 Sigma 公司产品，吖啶橙（acridineorange, AO）购自欣经科生物技术有限公司，JC-1 购自 Fluka 公司，0.4% 台盼蓝染液购自 Solarbio 公司。
1.1.2实验仪器 二氧化碳 CO 2 细胞培养箱（Thermo公司），移液器（德国 Eppendorf 公司）（型号为 2.5、20.0、200.0 及 1 000.0 μl），超净工作台（北京东联哈尔仪器制造有限公司），倒置荧光相差显微镜（日本Olympus 公司 IX71），酶联免疫检测仪（Bio Tek 公司ELX800），全功能酶标仪（Bio Tek公司Synergy H1），
高速低温离心机（德国 Eppendorf 公司，Centrifuge5424R），低速离心机（北京白洋淀医疗器械有限公司，320C），流式细胞仪（美国 BD 公司 FACSCanto Ⅱ）。
1.2 实验方法
1.2.1    小鼠腹腔巨噬细胞体外分离与培养 随机选取2 只 ICR 小鼠，腹腔注射不含血清培养基 5 ml，轻柔小鼠腹部 2 ～ 3 min，使液体在腹腔内充分流动，静置5 ～ 7 min 后将小鼠颈椎脱臼处死，置于解剖板上，无菌条件下打开腹腔，用眼科镊提起下腹皮肤，剪 1 个小口，并沿腹中线剪开 3 ～ 5 cm 的腹部皮肤，充分暴露腹膜，剪开腹部皮肤后在肌肉层剪 1 个小口，用吸管吸取腹腔灌洗液，并重复灌洗 1 次。
将 2 次收集的腹腔灌洗液转至 15 ml 离心管，1 000 r/min 离心 5 min，去上清，用 PBS 洗涤 2 遍。加入 DMEM 完全培养基（含 10% FBS、0.1% 青链霉素
溶液），用细胞计数板计数，显微镜下（×100）计数巨噬细胞。用 DMEM 完全培养基调节细胞数至 2×106个 /ml，接种于培养瓶及 96 孔板，放入 37℃、5% CO 2 、相对湿度≥ 95% 的培养箱中静置培养，使巨噬细胞充分贴壁。
孵育 4 h 后，去上清，用 DMEM 培养基洗涤 1、2次，去除非黏附的其他细胞，获得的贴壁细胞即为单层的巨噬细胞，放回培养箱中培养备用。另取巨噬细胞悬液 0.9 ml 于 1.5 ml 离心管中，加入 0.1 ml 0.4% 台盼蓝染液（终浓度为 0.04%），混匀，静置 2 ～ 3 min 后，取 1 滴染色的细胞悬液滴加入计数板中，置于显微镜下观察，分别计数死细胞、活细胞，计算活细胞占计数细胞的百分率，显示巨噬细胞的成活率达95%以上
1.2.2    RAW264.7 细胞的培养    RAW264.7 细胞为小鼠源巨噬细胞，培养在含 10% FBS、100 u/ml 青霉素和 100 μg/ml 链霉素的 DMEM 培养基中，置于 37℃、含 5％ CO 2 、相对湿度≥ 95% 的培养箱中培养，每隔2 ～ 3 天传代 1 次。取对数生长期的细胞用于实验。
1.2.3    细胞活性检测 按照 CCK-8 试剂盒说明书提供的方法，分别测定蔓荆子黄素对小鼠腹腔巨噬细胞及 RAW264.7 细胞的增殖抑制作用。
将小鼠原代分离的腹腔巨噬细胞，以细胞数 1×105 个/ml接种于96孔板，每孔100 μl，置于37℃、含5%CO 2 、相对湿度≥ 95% 的培养箱中培养，用含有不同浓度蔓荆子黄素（0、1、5、10 及 50 μmol/L）的完全培养基作用 24、48 和 72 h，每个浓度设置 4 个复孔，同时设空白组（只含有等量培养基）和对照组（含同数量细胞和等量培养基），每孔加入 10 μl CCK-8 溶液，37℃培养 4 h 后，使用 EXL-800 酶联免疫检测仪在450 nm 波长测定细胞样品的光密度（optical density,OD）。
取对数生长期 RAW264.7 细胞，以细胞数 1×105个 /ml 接种于 96 孔板，100 μl/ 孔，置于 37℃、含 5%CO 2 、相对湿度≥ 95% 的培养箱中培养，将蔓荆子黄素配制的溶液（DMSO 浓度 <0.15%），分别设定 0.0、0.1、0.5、1.0、2.0、5.0 及 10.0 μmol/L 不同浓度，每个浓度设 4 个复孔，同时设空白组（只含有等量培养基）和对照组（含同数量细胞和等量培养基），加药后分别将细胞继续培养 24、48 和 72 h，每孔加入 10 μlCCK-8 溶液，37℃培养 2 h，使用 EXL-800 酶联免疫检测仪在 450 nm 波长测定细胞样品的 OD 值。
按如下公式计算细胞活性 ：细胞活性（%）=[OD（加药）-OD（空白）]/[OD（对照）-OD（空白）]×100%，
计算细胞存活率 ；数据分析采用 SPSS 20.0 统计软件，计算抑制细胞生长达 50% 的各药物浓度，即半数抑制浓度，以 IC 50 值（50% inhibitory concentration）表示。相同实验重复 3 遍，计算平均值及标准差。绘制时间 -存活率折线图。
1.2.4    RAW264.7 细胞核 AO/EB 双染观察细胞凋亡     取对数生长期 RAW264.7 细胞，以细胞数 1×105个 /ml 接种于 96 孔板，每孔 100 μl，置于 37℃、5%CO 2 的培养箱内培养，待其贴壁后，用含有不同浓度蔓荆子黄素（0.0、0.1、1.0、5.0 及 10.0 μmol/L）的完全培养基作用细胞 48 h，每个浓度设置 4 个复孔，依次加入 AO 染色液（终浓度为 5 μg/ml）及 EB 染色液（终浓度为 10 μg/ml），4℃避光孵育 20 min 后，用 PBS 洗涤 2 次。使用蓝光荧光激发的滤光片，在倒置荧光相差显微镜下观察细胞核的染色情况并拍照。实验重复 3 次。
1.2.5    RAW264.7 细胞凋亡率检测     取对数生长期RAW264.7细胞，以细胞数2.5×105 个/ml接种于6孔板，每孔 2 ml，置于 37℃、5% CO 2 的培养箱内培养待贴壁，用含有不同浓度蔓荆子黄素（0.0、0.1、1.0、5.0及 10.0 μmol/L）的完全培养基作用细胞 48 h 后，胰酶消化后收集细胞，1 000 r/min 离心 10 min，去上清液，预冷 PBS 洗 2 次，制成单细胞悬液，离心去 PBS，加入冰预冷的 70% 的乙醇固定，4℃放置 8 h 以上，取出固定的样品，2 000 r/min 离心 10 min，去上清液，加入 1 ml 预冷 PBS 重悬细胞，离心后去上清收集细胞 ；
加入 PI 染液（终浓度为 150 μg/ml）染色，4℃避光染色 30 min，400 目筛网过滤 1 次，进行流式细胞仪检测。实验重复 3 次，计算平均值及标准差。
1.2.6    RAW264.7 细胞活性氧含量检测     取对数生长期 RAW264.7 细胞，以细胞数 1×106个 /ml 接种于96 孔板，每孔 100 μl，置于 37℃、5% CO 2 的培养箱内培养待贴壁。然后用含有不同浓度蔓荆子黄素（0.0、0.1、1.0、5.0 及 10.0 μmol/L）的完全培养基作用细胞 2 h，每个浓度设置 4 个复孔，并设置空白对照组、阳性对照组。
去除细胞培养液，每孔加入 100 μl 用无血清培养液稀释的 2',7'- 二氯荧光素二乙酸酯（终浓度为 10 μmol/L），阳性对照组加入 Rosup（终浓度为 10 μmol/L），37℃孵育 20 min 后去培养基，用无血清培养基洗涤 3 次。按照活性氧（ROS）检测试剂盒说明书提供的方法，在倒置荧光相差显微镜下观察并拍照，使用全功能酶标仪检测荧光值，激发波长设置为 488 nm，发射波长设置为 525 nm。实验重复 3 次，计算平均值及标准差。
1.2.7    RAW264.7 细胞线粒体膜电位的检测     取对数生长期 RAW264.7 细胞，以细胞数 1×105个 /ml 接种于 96 孔板，每孔 100 μl，置于 37℃、5% CO 2 的培养箱内培养，用含有不同浓度蔓荆子黄素（0.0、0.1、1.0、5.0 及 10.0 μmol/L）的完全培养基分别作用细胞24、48和72 h，每个浓度设置4个复孔。
去除细胞培养液，每孔加入 100 μl JC-1 染色液（终浓度为 5 μg/ml），37℃培养 20 min 后去培养基，用 PBS 洗涤 2 次。倒置荧光相差显微镜下观察并拍照，全功能酶标仪检测荧光值，检测 JC-1 单体时激发波长设置为 488 nm，发射波长设置为 530 nm ；检测 JC-1 聚合物时，激发波长设置为 529 nm，发射波长设置为 590 nm。实验重
复 3 次，计算平均值及标准差。
1.3 统计学方法
数据分析采用 SPSS 20.0 统计软件，计量资料以均数 ± 标准差（x±s）表示，比较使用单因素或重复测量设计的方差分析，两两比较采用 LSD- t 检验， P <0.05 为差异有统计学意义。