细胞转染及阳性单克隆细胞株的筛选

摘要：将处于对数期的A549细胞均匀地接种在6孔板中, 当细胞生长至50%~80%汇合时进行转染。按照 LipofectamineTM 2000转染试剂说明书操作, 6 h后加入含血清的培养基进行培养, 24 h后把细胞传到直径为10 cm的细胞培养皿中, 并在1 d后加入终浓度为0.3 μg/mL的嘌呤霉素进行筛选。

每3 d换1次含有嘌呤霉素的筛选培养基, 大约筛选12 d至单克隆细胞长出。挑取单克隆细胞, 进一步在6孔板中扩大培养。实验分为3组: 正常对照组(control)、阴性对照组(pSUPER)和实验组(pSUPER-SMC3)。

收集3组细胞, 用RIPA裂解液进行裂解, 提取细胞总蛋白并用BCA标准曲线法进行定量, 加入RIPA 裂解液和上样缓冲液补齐, 98 °C变性5 min。配置5% 的浓缩胶和10%的分离胶, 25 μg总蛋白经恒压150 V 电泳1 h后, 120 V电转70 min至PVDF膜。10%的脱脂奶粉室温封闭1 h, 分别加入SMC3抗体(1?4 000)、 GAPDH抗体(1?2 000), 4 °C摇床孵育过夜。1×TBST 洗膜3次, 每次8 min, 加入相应的二抗后室温摇床孵育1 h, 1×TBST洗膜3次后运用ECL法检测。

取RNA干扰成功的实验组(pSUPER-SMC3)、阴性对照组(pSUPER)和正常对照组(control)的A549 细胞, 调整细胞密度, 以2×103 /孔接种于96孔培养板中。每孔100 μL培养基, 设置5个复孔, 96孔板放入细胞培养箱中继续培养24、48、72、96 h, 每孔加入10 μL的CCK-8试剂后放入37 °C培养箱孵育1.5 h, 然后用酶标仪检测490 nm波长处的D值。

实验分别分为实验组(pSUPER-SMC3)、阴性对照组(pSUPER)和正常对照组(control), 每组设置 3个复孔。在实验之前先用血清饥饿12 h, 之后用胰蛋白酶消化并制作细胞悬液, 均加入100 μL(1×105 ) 的细胞悬液于Transwell小室上腔, 加入600 μL完全培养基于小室下腔, 放于置于37 °C、含5% CO2的培养箱中培养24 h, 用PBS洗涤后加入4%的固定20 min, 1%结晶紫染色液染色10 min, 棉签擦去上室内细胞, 拍照并进行细胞计数。

将培养瓶中培养至80%汇合的实验组(pSUPERSMC3)、阴性对照组(pSUPER)和正常对照组(control) 的细胞进行胰蛋白酶消化, 制成细胞悬液并进行计数, 将计数好的细胞铺在低黏附的24孔板里, 每孔1 000个细胞, 并设3个复孔。每孔加入无血清培养液[EGF(20 ng/mL)+Basic-FGF(20 ng/mL)+B27 添加剂(1?50)+肝素纳(4 μg/mL)+青/链霉素混合液 (100×)2 mL]。细胞置于培养箱内培养10~14 d, 每 2~3 d加入100 μL培养基, 观察克隆球的形成情况。细胞培养14 d左右, 即可进行拍照、计数。

把3组细胞的总蛋白进行SDSPAGE、转膜和封闭后, 分别加入CD133抗体(1?2 000)、 CD44抗体(1?4 000)、SMC3抗体(1?4 000)和GAPDH 抗体(1?2 000)摇床孵育过夜, 1×TBST洗膜3次, 每次 8 min, 加入相应的二抗后室温摇床孵育1h, 1×TBST 洗膜3次后运用ECL法检测。

实验中所得数据都采用GraphPad Prism 5进行处理分析, 计量数据均采用x _ ±s, 组间比较采用OneWay ANOVA分析, P<0.05为差异具有统计学意义。