解析免疫组化（IHC）实验步骤和注意事项

免疫组织化学 (immunohistochemistryIHC) 是一门利用酶、荧光素、生物素、重金属离子等作为示踪剂，通过免疫亲和 (抗原抗体特导性结合) 在组织切片或细胞薄片上原位显示追踪生物体内大分子物质动态变化规律的实用性染色技术。按其主要示踪原理可以分为免疫组化 (默认酶标法)、免疫荧光法、胶体金法等。免疫组化是利用抗原与抗体特异性结合的原理，通过化学反应使标记抗体的显色剂显色来确定组织细胞内抗原，对其进行定位、定性及定量的一项技术。IHC 是一项基础研究实验，其总体实验难度较低，但想要做出漂亮的染色结果却没有那么简单，往往在某一个细节的疏忽会导致结果的差异较大，下面为大家解析免疫组化实验步骤和注意事项。

作用: 通过颜色来显示蛋白质的有无、定位 (胞外、胞膜、胞浆、胞核)、含量变化。

一、样本种类:

按来源:①组织;②培养细胞

按制作方式:①石蜡片 (IHC-P)②冰冻片 (IHC-F)③细胞片 (ICC)


免疫组化荧光图 


免疫组化流程图

解析免疫组化实验步骤：

1、取材

快: 尽是半小时内取材完成
准: 刀、剪锋利，一步到位，轻夹轻放
大小:1 cmx1 cmX02 cm 左右最宜

2、固定

何时固定?
取材后立刻 ! 马上 !

用什么固定?
4% 多聚甲醛或福尔马林较通用，有致志外膜用 Canov 液，活检用 Bouin 液。

固定液用多少?
组织体积 20 倍以上最宜。量少应中途换液 1-3 次。

固定多久?
6-24 h 最佳。固定后尽快包埋成蜡块 (蜡块可保存几年时间而不影响实验结果)，固定越久所需修复强度越大，越容易出现自发荧光及非特异性染色。

3、切片

要保存简单 -- 选石蜡片 !
要速度快 -- 选冰冻片 !
要结构漂亮 -- 选石蜡片 !
抗原不稳定 -- 选冰冻片 !
抗原稳定 -- 石蜡片冰冻片皆可 !

4、烤片切多厚?

石蜡片 3-8um，一般 5um; 冰冻片 5-15um，一般 8um

石蜡片怎么捞片?
水温 40-45℃ 组织平整后玻片有油漆的一面贴近组织向斜上方提起

烤多久?
37℃ 过夜或 60℃1-2 h

注意: 使用防脱处理的玻片，冰冻片无需烤片

5、脱蜡至水

Step1: 二甲 ben (7 min)
Step2: 二甲 ben(7 min)
Step3: 二甲 ben(7 min)
Step4:100% 酒精 (7 min)
Step5:85% 酒精 (7 min)
Step6:70% 酒精 (7 min)

注: 具体脱蜡时间可结合室温做调整，以组织上的石蜡脱干净为准。

6、灭活

①一般组织使用 3% HzO2 室温孵育 10 min
内源性过氧化物酶在血管瘤肝胎盘、阑尾炎，坏死区域和急性炎症组织含量较高，这样的组织可以适当延长灭活时间
显色系统为过氧化物酶 (HRP) 系统，该步骤建议一定要做
碱性磷酸酶 (AP) 系统以及免疫荧光，该步可以不做
在灭活时，如组织片中出现细小且密集的气泡，表示过氧化物酶含量过高，这时用 3%H2Oz 溶液难以完全阻断，可以用 0.5% gao 碘 suan 溶液室温条件孵育 10 min.

7、抗原修复

抗原修复方式:
酶修复、高压热修复、微波热修复。微波热修复一般都能得到很好的效果

修复液的选择:
柠檬酸盐缓冲液 (PH60) 和 EDTA(PH80 或 9.0)。经验证对于大多数的抗体来说后者使用效果更优。

修复强度的选择:
固定时间越久，修复强度越强，旧标本修复强度强于新鲜标本

消化酶的使用:
不同的蛋白有最佳的消化酶，使用中要注意各种消化酶的最佳 PH 值

8、封闭

05%BSA 最常用
@ 血清，效果最全面
封闭血清与二抗同源 (比如二抗是山羊抗小鼠 gG，封闭液选择山羊血清)，与一抗不能同源

9、抗体孵育

0 单抗和多抗各有优势，按需选用
一抗 4C 孵育效果最佳，备选 37℃1-2 h
二抗需与一抗的种属、类别或亚类相匹配推荐护、山羊、绵羊等种属
0 二抗/SABC 一般 37℃ 孵育 30 min10 显色
0DAB 显色液现用现配②建议镜下控制反应时间
根据显色时间的长短反向优化前期的实验条件

11、复染/返蓝

oMayerS 苏木素复染 (不易过染)
碱性溶液浸泡返蓝 (如 an 水、饱和磷酸氢二钠溶液等)
免疫荧光实验可选用 DAPI 等核染料复染细胞核，无需做返蓝

12、脱水透明

Step1:70% 酒精 (3 min)
Sted2:85% 洒精 (3 min)
Step3:100% 酒精 (3 min)
Step4: 二甲 ben(3 min) Step5: 二甲 ben(3 min) Step6: 二甲 ben(3 min)

注: 免疫荧光实验，该步骤可以不做。

13、封片

在封片阶段我们通常是用中性树胶来进行，封片过程中注意斜靠盖玻片防止气泡的产生从而对结果进行营影响，建议最好在通风橱操作，这样有利于气泡排除干净，不影响后续的镜检。