讲解 PCR 反应原理与要素

聚合酶链式反应（PCR）是一种用于放大扩增特定的 DNA 片段的分子生物学技术，它可看作是生物体外的特殊 DNA 复制，PCR 的最大特点是能将微量的 DNA 大幅增加。

原理:

PCR 技术的基本原理类似于 DNA 的天然复制过程，其特异性依赖于与靶序列两端互补的寡核苷酸引物。
PCR 由变性-退火-延伸三个基本反应步骤构成：
模板 DNA 的变性：模板 DNA 经加热至 93℃ 左右一定时间后，使模板 DNA 双链或经 PCR 扩增形成的双链 DNA 解离，使之成为单链，以便它与引物结合，为下轮反应作准备；
模板 DNA 与引物的退火（复性）：模板 DNA 经加热变性成单链后，温度降至 55℃ 左右，引物与模板 DNA 单链的互补序列配对结合；
引物的延伸：DNA 模板-引物结合物在 72℃、DNA 聚合酶（如 TaqDNA 聚合酶）的作用下，以 dNTP 为反应原料，靶序列为模板，按碱基互补配对与半保留复制原理，合成一条新的与模板 DNA 链互补的半保留复制链。
重复循环变性-退火-延伸三过程就可获得更多的「半保留复制链」，而且这种新链又可成为下次循环的模板。每完成一个循环需 2～4 分钟，2～3 小时就能将待扩目的基因扩增放大几百万倍。

PCR 反应的五要素：




1、引物

引物是 PCR 特异性反应的关键，PCR 产物的特异性取决于引物与模板 DNA 互补的程度。理论上，只要知道任何一段模板 DNA 序列，就能按其设计互补的寡核苷酸链做引物，利用 PCR 就可将模板 DNA 在体外大量扩增。
设计引物应遵循以下原则：

①引物长度： 15-30bp，常用为 20bp 左右。
②引物扩增跨度： 以 200-500bp 为宜，特定条件下可扩增长至 10kb 的片段。
③引物碱基：G+C 含量以 40-60% 为宜，G+C 太少扩增效果不佳，G+C 过多易出现非特异条带。ATGC 蕞好随机分布，避免 5 个以上的嘌呤或嘧啶核苷酸的成串排列。
④避免引物内部出现二级结构，避免两条引物间互补，特别是 3』端的互补，否则会形成引物二聚体，产生非特异的扩增条带。
⑤引物 3』端的碱基，特别是蕞末及倒数第二个碱基，应严格要求配对，以避免因末端碱基不配对而导致 PCR 失败。
⑥引物中有或能加上合适的酶切位点，被扩增的靶序列最 hao 有适宜的酶切位点，这对酶切分析或分子克隆很有好处。
⑦引物的特异性：引物应与核酸序列数据库的其它序列无明显同源性。引物量：每条引物的浓度 0.1～1umol 或 10～100pmol，以蕞低引物量产生所需要的结果为好，引物浓度偏高会引起错配和非特异性扩增，且可增加引物之间形成二聚体的机会。

2、酶

目前有两种 Taq DNA 聚合酶供应， 一种是从栖热水生杆菌中提纯的天然酶，另一种为大肠菌合成的基因工程酶。催化一典型的 PCR 反应约需酶量 2.5U(指总反应体积为 100ul 时)，浓度过高可引起非特异性扩增，浓度过低则合成产物量减少。

3、dNTP

dNTP 的质量与浓度和 PCR 扩增效率有密切关系，dNTP 粉呈颗粒状，如保存不当易变性失去生物学活性。dNTP 溶液呈酸性，使用时应配成高浓度后，以 1M NaOH 或 1M Tris。HCL 的缓冲液将其 PH 调节到 7.0～7.5，小量分装， -20℃ 冰冻保存。多次冻融会使 dNTP 降解。

在 PCR 反应中，dNTP 应为 50～200umol/L，尤其是注意 4 种 dNTP 的浓度要相等 ( 等摩尔配制)，如其中任何一种浓度不同于其它几种时 (偏高或偏低)，就会引起错配。浓度过低又会降低 PCR 产物的产量。dNTP 能与 Mg2+结合，使游离的 Mg2+浓度降低。

4、模板

模板核酸的量与纯化程度，是 PCR 成败与否的关键环节之一，传统的 DNA 纯化方法通常采用 SDS 和蛋白酶 K 来消化处理标本。SDS 的主要功能是：溶解细胞膜上的脂类与蛋白质，因而溶解膜蛋白而破坏细胞膜，并解离细胞中的核蛋白，SDS 还能与蛋白质结合而沉淀；蛋白酶 K 能水解消化蛋白质，特别是与 DNA 结合的组蛋白，再用有机溶剂酚与 lv 仿抽提掉蛋白质和其它细胞组份，用乙醇或异丙醇沉淀核酸。提取的核酸即可作为模板用于 PCR 反应。

一般临床检测标本，可采用快速简便的方法溶解细胞，裂解病原体，消化除去染色体的蛋白质使靶基因游离，直接用于 PCR 扩增。RNA 模板提取一般采用异硫氰酸胍或蛋白酶 K 法，要防止 RNase 降解 RNA。

5、Mg2+浓度

Mg2+对 PCR 扩增的特异性和产量有显着的影响，在一般的 PCR 反应中，各种 dNTP 浓度为 200umol/L 时，Mg2+浓度为 1.5～2.0 mmol/L 为宜。Mg2+浓度过高，反应特异性降低，出现非特异扩增，浓度过低会降低 Taq DNA 聚合酶的活性，使反应产物减少。