ELISA实验出现显色淡灵敏度偏低原因

ELISA实验以灵敏度较高、特异性较好的特点得到了广泛的应用，但操作中的各个环节对试验的检测效果影响较大，如不注意，有可能导致显色淡，灵敏度偏低结果。ELISA实验结果显色淡灵敏度偏低原因有以下几种分别是：
原因1：试剂盒未充分平衡

解决办法：试剂盒从2～8℃冰箱取出后打开盒盖，于室温平衡至少20分钟，确保所有试剂已平衡至室温（约25℃）。

原因2：样品不适合做ELISA检测   

解决办法：样品一般选择培养上清、血清、血浆。其他样品形式可能不适合做ELISA检测或者需要优化检测的条件（例如稀释液的成分）。

原因3：酶标板在贮存或洗后拍干时过分干燥

解决办法：防止板过于干燥。

原因4：包被抗体遭到破坏

解决办法：操作温和，移液枪不能碰到孔底。

原因5：样本和抗体孵育条件不合适

解决办法：按照说明书条件，建议孵育过程中全程振荡孵育。

原因6：洗涤浸泡时间过长

解决办法：按照说明书操作，勿人为增加浸泡时间。

原因7：偶联HRP试剂污染

解决办法：弃去试剂，重新配置。

原因8：错误的误稀释偶联HRP试剂

解决办法：弃去试剂，重新配置。

原因9：TMB底物孵育时间过短，因非人为因素影响，需要优化孵育时间

解决办法：确定合适的孵育时间人为判定-最高浓度S1出现深蓝色，S4-5有淡蓝色。或机器判定620 nm波长下测定OD值达到0.6-0.65。

原因10： 样本浓度过高或存在基质效应

解决办法：建议做不同稀释倍数，确认样本最佳稀释倍数。

原因11：酶标仪滤光片设置有问题或者波长选择不对

解决办法：确认仪器设置及选择正确的波长检测。

原因12： 酶标板不适合做ELISA

解决办法：不能使用细胞培养板，建议使用ELISA专用高吸附力板子。

总结整理如下表：

总结为避免显色淡灵敏度低，需注意事项：

1、 常规ELISA试剂盒平衡至30min；

2、 检测抗体、偶联HRP请按说明书稀释比；

3、 样本、抗体孵育条件（温度、转速），请根据说明书；

4、 控制TMB底物显色时间。