RNA降解原因与防止RNA降解遵守规则

8550 人阅读发布时间：2022-06-16 16:02

RNA抽取一般使用Trizol法抽提：
Trizol是一种总RNA抽提试剂，内含异硫氰酸胍等物质，能迅速裂解细胞，抑制细胞释放出的核酸酶活性。目前常用Trizol法进行提取组织或细胞中的RNA。
Trizol作用原理:
在匀质化或溶解样品中，Trizol试剂可保持RNA的完整性，同时能破坏细胞及溶解细胞成分。加入lv仿离心后，裂解液分层成水相和有机相。RNA存在于水相中。
水相转移后，RNA通过异丙醇沉淀回收。移去水相后，用乙醇可从中间相沉淀得到DNA，加入异丙醇沉淀可从有机相得到蛋白质。
接下来了解RNA提取中RNA降解原因：
一、RNA降解原因：
1 、新鲜细胞：
裂解液的量不足，使得裂解不充分。
2 、新鲜组织：
某些含有内源性核酸酶的样品，很难避免RNA酶的降解，建议采用的方法为在液氮条件下将组织研碎，并且，匀浆时采用更多的裂解液。
3 、冷冻样品：
样品取材后应该迅速置于液氮中冷冻存放，然后转移到-70℃冰箱存放。如果未经液氮速冷直接转移到-70℃冰箱存放，会造成RNA缓慢降解。样品研磨后，在液氮刚刚挥发完时，将样品迅速转移到含裂解液的容器中，立即混匀匀浆。
4 、内源 RNA 酶的污染：
抑制剂失效或者用量不够，实验样品过多或者匀浆温度过高。
5 、外源 RNA 酶的污染：
试剂、器械等实验用品应该采用DEPC 水灭菌处理。

RNA降解是非常严重的问题，在RNA提取过程中，为防止降解我们需要遵守以下4点基本规则：
二、基本规则：
1. 把所有接触RNA的塑料制品以及玻璃制品都高压灭菌。
2. 用于RNA 缓冲液的所有水都要经DEPC处理。加DEPC到终浓度0.1%，再室温放放置过夜，或者灭菌15min 。DEPC 不能用于Tris 缓冲液，因为DEPC将会降解成乙醇和二氧化碳。
3. 避免碱性缓冲液，因为RNA中的羟基对碱非常敏感。
4. 将RNA 缓冲液与其他缓冲液分开放置，避免用错或被RNases污染。

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