免疫荧光技术方法及其主要步骤

1800 人阅读发布时间：2022-06-23 09:46

免疫荧光技术是根据抗原抗体反应的原理，先将已知的抗原或抗体标记上荧光素，制成荧光抗体，再用这种荧光抗体（或抗原）作为探针检测组织或细胞内的相应抗原（或抗体）。在组织或细胞内形成的抗原抗体复合物上含有标记的荧光素，利用荧光显微镜观察标本，荧光素受外来激发光的照射而发生明亮的荧光（黄绿色或橘红色），可以看见荧光所在的组织细胞，从而确定抗原或抗体的性质、定位，以及利用定量技术测定含量。由于免疫荧光技术特异性强、灵敏度高、快速简便,所以在临床病理诊断、检验中应用较广。一般有直接法和间接法
两个荧光抗体技术方法：
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1. 直接法
直接法是荧光抗体技术蕞简单、基本的方法。它通过标记抗体直接与相应抗原（待检抗原标本）结合，来鉴定未知抗原。
其优点为：
①由于在反应中只有两种因子参与，结果判断较简单；
②特异性强，与其他抗原交叉染色较少；
③操作步骤少，方法简便、省时。
其缺点有：
①敏感性较差；
②一种标记抗体只能鉴定一种抗原；
③不能用于鉴定未知抗体。
2. 间接法
间接法是目前蕞常用的方法。首先用已知未标记的抗体（第1抗体）与待检抗原反应或用未知抗体与已知抗原反应，反应一定时间后，洗去未结合的抗体，再与标记的抗免疫球蛋白抗体（二抗）反应。在第1步反应中，若抗原抗体发生了反应，则抗体被固定在标本上，那么第二步反应中标记的抗体（二抗）必然与第1步反应形成的抗原抗体复合物中的抗体发生反应，这样就可以通过二抗的示踪，对标本中未知抗原或抗体进行鉴定。
其优点为：
①敏感性较高，是直接法的5-10倍；
②用一种标记的抗体，就能与一种以上的相应的抗体或抗原配合鉴定多种未知的抗原或抗体；
③既能鉴定未知抗原，又能鉴定未知抗体。
其缺点有：
①在反应中有多种因子参与，容易产生非特异性染色，结果判断有时较困难；
②操作步骤多，费时。

免疫荧光方法中主要步骤:

1、冰冻切片制备:

建议用新鲜组织,否则组织细胞内部结构破坏,易使抗原弥散。选用干净锋利的刀片、组织一定要冷冻适度等,防止裂片和脱片。
2、组织切片固定:
切好片风干后立即用冰丙酮等固定液进行固定5-10min,尤其要较长时间保存的白片,一定要及时固定和适当保存。
3、血清封闭:
为防止内源性非特异性蛋白抗原的结合,需要在一抗孵育前先用血清(与二抗来源一致)封闭,减弱背景着色。血清封闭的时间是可以调整的,一般10-30min。
4、一抗孵育条件:
在免疫组化反应中最重要,包括孵育时间和抗体浓度。一抗孵育温度有几种:4度、室温、37度,其中4度效果更佳;孵育时间:这与温度、抗体浓度有关,一般37度1-2h,4度过夜(从冰箱拿出后37度复温45min)。具体条件还要摸索。
5、二抗孵育条件:
一般室温或37度30min-1h,具体时间需要摸索,而浓度一般有工作液,若是浓缩液还要摸索浓度,一定要避光反应。但在免疫荧光中我们一般先把二抗浓度和孵育时间先定下,然后去摸索一抗浓度和孵育时间。最后,荧光素标记的二抗随着保存时间的延长,可能会有大量的游离荧光素残留,需要注意配制时小包装和并进行适当的离心。
6、复染:
目的是形成细胞轮廓,从而更好地对目标蛋白进行定位。一般常用DAPI复染。
7、封片:
为了长期保存,我们一般用缓冲甘油等封片,此外还有专门的抗荧光萃灭封片液。避免产生气泡,方法是直接在载玻片组织上滴一滴封片液,然后一手拿住盖片某一拐角,而另一手拿对面的那个拐角,接近封片液近端的拐角先降低,直至接触到液体时为止;当发现液体接触面在不断弥散时,则可以缓慢降低另一拐角,这样一般不会产生气泡。
8、切片清洗:
为了防止一抗、二抗等试剂残留而引起非特异性染色,所以适当地加强清洗(延长时间和增多次数)尤为重要,一般在一抗孵育前的清洗是3min*3次,而一抗孵育后的清洗均为5次*5min。
注意:
(1)单独冲洗,防止交叉反应造成污染。
(2)温柔冲洗,防止切片的脱落。我喜欢用浸洗方式;
(3)冲洗的时间要足够,才能彻底洗去结合的物质。
(4)PBS的PH和离子强度的使用和要求(建议PH在7.4-7.6,浓度是0.01M;中性及弱碱性条件有利于免疫复合物的形成,而酸性条件则有利于分解;低离子强度有利于免疫复合物的形成,而高离子强度则有利于分解)
9、拍照:
有条件的话更好立即拍照,若不能及时拍照,也要封好片和用指甲油封固,保持避光和湿度。使用荧光显微镜注意严格按照荧光显微镜出厂说明书要求进行操作,不要随意改变程序;应在暗室中进行检查;防止紫外线对眼睛的损害,在调整光源时应戴上防护眼镜;检查时间每次以1~2h为宜,超过90min,超高压汞灯发光强度逐渐下降,荧光减弱;标本受紫外线照射3~5min后,荧光也明显减弱或褪色;激发光长时间的照射,会发生荧光的衰减和淬灭现象;所以最多不得超过2~3h;荧光显微镜光源寿命有限,标本应集中检查,以节省时间,保护光源。天热时,应加电扇散热降温,新换灯泡应从开始就记录使用时间。灯熄灭后欲再启用时,须待灯光充分冷却后才能点燃。中应避免数次点燃光源。关闭汞灯至少在开启15-30分钟后;标本染色后立即观察,因时间久了荧光会逐渐减弱。若将标本放在聚yi烯塑料袋中4℃保存,可延缓荧光减弱时间,防止封裱剂蒸发;使用的玻片等载体,都必须厚度均匀,无明显的自发荧光,如果使用油镜,还必须保证镜油为无荧光镜油;电源更好装稳压器,否则电压不稳不仅会降低汞灯的寿命,也会影响镜检的效果。

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