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qPCR法检测端粒长度的具体步骤
223 人阅读发布时间：2025-11-10 11:55
qPCR法检测端粒长度的具体步骤如下：
1、DNA抽提
使用血液、口腔拭子或细胞样本，通过商业化DNA抽提试剂盒（如TIANamp Genomic DNA Kit）提取基因组DNA，洗脱体积通常为50μL TE缓冲液。要求DNA纯度A260/A280≈1.8，浓度标化为15-20ng/μL。
2、qPCR反应体系配制
在冰上配制反应液，以20μL体系为例：
HieffTM qPCR SYBR® Green MasterMix：5μL
端粒引物（10μM）：0.2μL
单拷贝基因引物（10μM）：0.2μL
模板DNA：2μL
补足至10μL的RNase Free dH2O
3、qPCR扩增程序
基线设置：内参基线设为6-12个循环，端粒基线设为3-7个循环。
阈值设置：内参CT值定为17±1，端粒CT值定为12±1。
使用ABI 7500等定量PCR仪运行程序，需设置阴性对照（无模板）和标准品对照。
4、数据分析
计算端粒信号（T）与单拷贝基因信号（S）的比值（T/S），该比值与端粒相对长度成正比。若需绝对定量，需与已知端粒长度的参考样本比较。
注意事项：
避免气溶胶污染，使用带滤芯吸头和专用移液器。
预混反应组分以减少孔间误差。
样本需技术重复（建议3次），阴性对照单重复。
1、DNA抽提
使用血液、口腔拭子或细胞样本，通过商业化DNA抽提试剂盒（如TIANamp Genomic DNA Kit）提取基因组DNA，洗脱体积通常为50μL TE缓冲液。要求DNA纯度A260/A280≈1.8，浓度标化为15-20ng/μL。
2、qPCR反应体系配制
在冰上配制反应液，以20μL体系为例：
HieffTM qPCR SYBR® Green MasterMix：5μL
端粒引物（10μM）：0.2μL
单拷贝基因引物（10μM）：0.2μL
模板DNA：2μL
补足至10μL的RNase Free dH2O
3、qPCR扩增程序
基线设置：内参基线设为6-12个循环，端粒基线设为3-7个循环。
阈值设置：内参CT值定为17±1，端粒CT值定为12±1。
使用ABI 7500等定量PCR仪运行程序，需设置阴性对照（无模板）和标准品对照。
4、数据分析
计算端粒信号（T）与单拷贝基因信号（S）的比值（T/S），该比值与端粒相对长度成正比。若需绝对定量，需与已知端粒长度的参考样本比较。
注意事项：
避免气溶胶污染，使用带滤芯吸头和专用移液器。
预混反应组分以减少孔间误差。
样本需技术重复（建议3次），阴性对照单重复。