PCR产物纯化的详细步骤，新手也能轻松上手

PCR反应后体系中含有引物、dNTPs、Taq酶等杂质，会影响下游实验（如克隆、测序），因此需对目标DNA片段进行纯化。根据电泳结果是否单一，可选择直接纯化或凝胶回收。

常见纯化方法及步骤

1.硅胶层析柱法（离心柱法）

该方法利用硅胶膜在高盐条件下特异性吸附DNA，通过洗涤去除杂质，最后用低盐缓冲液或水洗脱DNA 。

操作步骤：

将PCR产物与结合缓冲液（如GC Buffer）混合，促进DNA与膜结合；

转移至离心柱中，离心使DNA吸附于膜上；

加入洗涤缓冲液（如Wash Buffer），离心去杂质，重复1–2次；

空管离心以去除残留乙醇；

滴加洗脱液（如ddH₂O或Elution Buffer），静置后离心得纯化DNA 6。

✅ 优点：操作简便、产物纯度高；

❌ 缺点：存在堵柱风险，小片段（<100 bp）回收率低。

2.磁珠法（基于SPRI原理）

磁珠表面修饰有羧基，在特定离子强度下可逆结合DNA，通过外加磁场实现固液分离。

操作步骤：

向PCR产物中加入醋酸钠和无水乙醇，调节溶液极性；

 加入磁珠悬液，混匀后室温孵育，使DNA结合磁珠；

将离心管置于磁力架上，吸附磁珠并移除上清；

用75%乙醇洗涤1–2次；

干燥后加入洗脱缓冲液或水，释放DNA。

✅ 优点：通量高、可自动化、安全性好；

❌ 缺点：成本较高，部分小片段回收效率低。

3.凝胶回收纯化（适用于非特异性扩增）

当电泳出现多条带时，需切取目的条带进行回收：

进行琼脂糖凝胶电泳，紫外灯下切下目标DNA条带；

使用胶回收试剂盒溶胶（加热或加溶胶液）；

后续步骤同硅胶柱法或磁珠法处理溶胶液。

回收率低于直接纯化，但纯度更高。

方法	原理	主要步骤	优点	缺点	推荐场景
硅胶层析柱法	高盐下DNA结合硅胶膜	结合→离心→洗涤→洗脱	操作简单、纯度高	小片段回收差、难自动化	小批量、条带单一样本
磁珠法	SPRI原理，磁珠吸附DNA	结合→磁吸→洗涤→洗脱	可自动化、高通量	成本高、需磁力架	高通量、临床检测
凝胶回收法	切胶后释放DNA再纯化	电泳→切胶→溶胶→纯化	纯度极高	回收率低、耗时长	多条带需精确回收

补充说明：PEG沉淀法也可用于纯化，但回收不稳定，已较少使用。

建议

若PCR产物条带单一，优先选用硅胶柱法或磁珠法进行直接纯化；

若有杂带，则必须进行凝胶回收；

对于高通量项目，推荐使用磁珠法+自动化设备，提升效率与一致性。