提高细胞传代存活率的核心技巧，简单好操作

细胞传代是体外培养中的常规操作，但不当处理易导致细胞损伤或死亡。贴壁细胞需经消化脱离培养表面，而此过程中的胰酶浓度、作用时间及后续操作均直接影响细胞活力。悬浮细胞虽无需消化，但也需注意离心力与接种密度。因此，标准化操作流程对维持细胞健康至关重要。

关键操作要点

1、控制胰酶消化条件

使用推荐浓度（如0.25%胰蛋白酶-0.04%EDTA）；

消化时间一般为2–10分钟，需在显微镜下监控至70%–80%细胞变圆即可终止；

避免长时间消化损伤细胞膜。

2、终止消化与细胞处理

立即加入含血清的完全培养基以中和胰酶活性；

吹打动作轻柔，避免产生气泡造成机械损伤；

可使用细胞过滤器去除碎片，提高悬液均匀性。

3、优化接种密度

接种密度过低会导致细胞增殖缓慢甚至老化；过高则引发营养竞争；

建议活细胞接种密度为 (2.5–4)×10⁴ 个/cm²，具体依细胞类型调整；

如PANC-1细胞可按1:2比例传代，Kasumi-1推荐200–300万细胞/mL冻存。

4、确保无菌与适宜环境

所有耗材灭菌处理，优先使用一次性器材；

培养箱维持37°C、5% CO₂、高湿度环境；

提前将培养基预热至37°C，避免温度波动影响细胞状态。

操作环节	推荐做法	注意事项
消化液选择	0.25% Trypsin-0.04% EDTA，预热至37°C	不同细胞敏感度不同，需优化条件
消化时间	显微镜监控，70%-80%细胞变圆即停止	时间过长损伤细胞，过短脱落不充分
终止消化	加入含血清培养基迅速混匀	血清可抑制胰酶活性
离心参数	900–1000 rpm，3–5 min	过高速度易损伤细胞，尤其脆弱细胞系
接种密度	(2.5–4)×10⁴ 活细胞/cm²；干细胞类可能需更高密度	密度过低易致老化，过高诱发分化
培养基更换频率	每2–3天更换一次，或根据细胞代谢情况调整	代谢产物积累会抑制生长

注：对于原代细胞或难养细胞，可采用包被培养皿（如多聚赖氨酸）提升贴壁率，并选用高质量血清以增强支持能力。

建议

定期观察细胞形态与生长状态，避免传代过晚导致接触抑制。传代后次日若漂浮细胞较多，应及时换液清除死细胞。同时勤换液、勤传代有助于延缓细胞老化。若细胞状态持续不佳，建议排查污染、试剂批次或培养箱稳定性问题。