解析免疫印迹（WB）实验关键步骤

2851 人阅读发布时间：2022-06-27 16:09

免疫印迹（Western blot, WB）是蛋白组学中检测复杂生物提取物中特定蛋白质存在的最常用方法之一。WB先要进行 SDS-PAGE，然后将分离开的蛋白质样品用电转仪转移到固相载体上，而后利用抗原 - 抗体 - 标记物显色来检测样品，可以用于定性和半定量。

免疫印迹（WB）实验操作流程：
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免疫印迹（WB）实验关键步骤讲解：
一、蛋白样品的制备
按组织净重(g)：裂解液体积(ml)=1：10的比例加入相应体积的裂解液(加入终浓度为1mM的PMSF、适当浓度的蛋白酶抑制剂和磷酸化酶抑制剂，以避免内源性酶分解蛋白，影响蛋白质的抽提)进行匀浆。
蛋白质的样品制备是westemblotting的第一步，也是关键步骤，要想获得所有蛋白质，应注意以下问题：
1、在合适的盐浓度下，应保持蛋白质的最大溶解性和可重复性；
2、选择合适的表面活性剂和还原剂，破坏所有非共价结合的蛋白质复合物和共价二硫键，使其形成各自多肽的溶液；
3、尽量去除核酸，多糖，脂类等分子的干扰，在裂解完毕离心之后小心取中层澄清溶液，注意不要吸到底层沉淀和上层脂类；
4、防止蛋白在处理过程中的人为修饰，制备过程必须在低温下进行，以避免细胞破碎释放出各种酶类的修饰。(注意：可以适当加入PMSF等酶抑制剂)
5、样本制备完后分装保存，但是注意不要反复冻融。
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免疫印迹（WB）实验流程

二、凝胶的制备
30%的PAG配置完后过滤于4C保存，10% SDS室温保存。AP不稳定，用时现配。（注意：分子量较小的蛋白选用较大浓度的凝胶）
制胶关键是聚合时间，分离胶聚合控制在从加入10% AP和TEMED至开始凝胶，时间为10-20min(未完全凝聚)，浓缩胶最佳聚合时间为8-10min，可通过控制AP和TEMED量来控制。AP和TEMED的量过高，局部胶疑的太快，会使疑胶不均匀，电泳蛋白条带会弯曲。环境温度较高时，应减少AP和TEMED的量。空气中氧气也会影响胶的聚合，所以在分离胶上面应加一层水或正ding醇以隔绝氧气。
三、电泳常见问题
1、条带出现微笑现象(中间凹两边翘起)：主要是凝胶中间部分凝固不均所致，应待凝胶充分凝固后电泳，或者催化剂加入后充分混匀；
2、条带出现“皱眉”现象(中间鼓坡两边向下)：两玻璃板之间底部气泡所致，应排除底部气泡；
3、带出现拖尾现象：主要是样本溶解效果不佳，分离胶浓度过大，电泳缓冲液放置时间过长。建议：加样前离心，选择适当的样本缓冲液，加适量的样品促溶
剂；使用新配置的电泳缓中液，降低凝胶浓度或使用梯度凝胶。
4、蛋白条带出现纹理现象：样品不溶性颗粒引起的。建议：加样前离心，加入适量的促溶剂。
5、指示的澳酚蓝已跑出底板，但蛋白质未跑下来：与缓冲液和分离胶的浓度有关应更换正确PH值的缓冲液，降低凝胶浓度或使用梯度凝胶
四、转印
湿式电转印注意事项：
1、要使蛋白质组分能有效的从凝胶转移到固相纸膜上，缓冲液的PH值很重要，有些分子量不是很大的蛋白质区带，即使延长电转印时间也不能从凝胶转移到膜上。这是由于蛋白质在转移缓冲液中恰好处于等电点状态造成的，因此应适当改变转移缓冲液的PH，以利于转膜。另外，对于分子量较小的蛋白质，可在缓冲液中加入适量甲醇，因为甲醇能促进它们固定在固相膜上。但是对于大分子量的蛋白质，尤其是碱性蛋白质，缓冲液中是不宜加入甲醇的，因为甲使凝胶孔径变小，不利于分子量较大的蛋白的转移，甲醇能将结合在碱性蛋白质上的SDS解离出来而使其带正电或呈电中性蛋白质就更难从凝胶中转移出来；
2、电转印膜的选择：有NC膜、重氮化膜和阳离子尼龙膜，PVDF膜。其中NC膜使用的最为普遍，它的蛋白质容量大，可用各种染色方法进行检测，但是它与蛋白质的结合是非价性的，膜干燥后很脆。此外膜的孔径大小也是考虑的重要因素，目的蛋白30KD以下用0.22 um孔径的NC膜，30KD以上用0.45 um孔径的NC膜；
3、转印选择恒流，每个转印槽150 mA，10KD以下转印40min，10-30KD转印50min，30-100KD转印70min，100kd以上转印80min，转印完毕可用丽春红S染膜检测转印是否成功，转印结束后去除NC膜置于丽春红S溶液中，室温5-10min即可看见红色条带，用TBS洗数次即可洗掉红色条带进行后续实验。
五、封闭
1、电泳转膜过后，膜上其他没有结合蛋白质的空白位置需要用封闭液加以封闭，以避免一抗或二抗非特异性结合。这是由于WB的灵敏度很大程度上取决于封闭的好坏，封闭时间过长(过度封闭)导致抗原表位的遮蔽，从而降低检测灵敏度，封闭时间过短(不完全封闭)又会导致最终背景增高或信噪比太低，因此封闭液的选择和条件的优化很重要；
2、封闭液中应加入适量的防腐剂，避免封闭蛋白变性影响封闭效果。
六、抗体的杂交
1、若非特异性条带过多，可适当降低抗体的浓度，增加洗膜次数，蛋白电泳前延长变性时间，减少上样蛋白量，延长封闭时间；
2、若信号弱，可能转膜不完全，可优化转移时间和电流，增加抗体的浓度，适当延长曝光时间；
3 、若背景较高，可适当降低抗体的浓度，过滤二抗，延长封闭时间，增加漂洗时间，减少曝光时间。
七、检测
1、胶片曝光几秒到数分钟，具体情况要看膜上化学发光条带明暗强度而定。胶片曝光时间不宜过长，时间过长会照成胶片背景变深。冲洗胶片以确定所测抗原
的正确曝光时间；
2、冲洗胶片的步骤：曝光完的胶片先在显影液中冲洗至出现条带为止，一般在1min以内，时间过长也会照成胶片背景变深。再放入定影液中漂洗，十秒即可
显影液漂洗完后，要多用清水冲洗，以免定影液中成分残留在胶片上。

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